环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。 随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。 根据circRNA序列的来源，可以分为3类： 1. 序列全部来源于外显子，称为Exonic circRNAs 2. 序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs 3. 序列全部来源于内含子，称为ciRNAs。 circRNA是由mRNA前体（pre-mRNA）经反向剪接（back-splicing）形成的，目前报道的成环模型主要有以下3种： · 内含子反向互补序列驱动环化环化 外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，反向互补序列促使内含子序列配对，使得下游的剪接供体（Splice-Donor）与上游的剪接受体（Splice-Acceptor）靠近，从而结合形成环状RNA。（图1.左） · RNA结合蛋白驱动环化 环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白（RBPs）识别的基序，RBP分别与两翼内含子特异基序结合后，会形成二聚体，促进两翼内含子互相靠近，进而连接成环。（图1.右） · 套索驱动环化 mRNA前体剪接时，会发生外显子跳读事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，随后该中间体发生反向剪接，形成环状RNA。（图2.） circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子： Cdr1as，它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点，其中与miR-7的结合方式是非完全互补，只是结合，不会被AGO2蛋白介导降解，而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，无法抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌症的发生。当miR-671高表达时，Cdr1as被降解，miRNA得到释放，与原癌基因mRNA结合，起到基因下调的作用，抑制癌症的发生。（图3.） 很多环状RNA上含有蛋白结合的位点，可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL，可结合亲本基因第二外显子，促使其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl又能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少MBL生成。 除了作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。 （参考文献：Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.） 随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌，食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。 除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，检测及治疗方面也可以起到重要的作用。 circRNA敲除方案比较难设计，一般会使用以下两种方法： 方案一：将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端，直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，需要根据具体的实验目的考虑是否可行。 方案二：通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件，成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后，在两端设计gRNA进行敲除，既不破坏编码基因的外显子，又可以实现circRNA的敲除（图4.） 应用案例： circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） 在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。 源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。 应用案例： 用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。 利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA 载体表达 系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。（图9.）
自 20 世纪 70 年代末开始，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势。美国女性乳腺癌的患病率高达。中国虽然不是乳腺癌的高发国家，但是近年来我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家 1～2 个百分点。同时，在卫计委公布的 2013 年年鉴中显示，我国在2004年到2005年间，乳腺癌的已经成为女性死亡率最高的生殖系统肿瘤。甚至有研究表明，现在在中国，与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症。 多梳基因家族（polycomb group，PcG）蛋白PcG是一类表观遗传抑制因子，包括PRC1和PRC2两大复合物，在决定细胞命运以及肿瘤发生等方面发挥重要作用。PCGF1是多梳基因家族PRC1复合体的重要组成部分，该复合体主要包括PCGF蛋白、CBX蛋白，RING1蛋白和HPH蛋白。 前期研究发现PCGF1在多种肿瘤细胞中表达丰度较高，尤其以乳腺癌细胞和胶质瘤细胞表达尤为明显。以PCGF1序列为模板，设计sgRNA干扰序列，两端加入载体连接序列。通过DNA片段合成所需sgRNA序列。退火形成oligo二聚体序列后，使用T4 DNA连接酶重组干扰序列与pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒，最终成功构建 PCGF1 敲低载体。将pCAG-T7-Cas9-gRNA-pgk-Puro-T2AGFP重组载体通过脂质体转染MCF7细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，Western blotting检测PCGF1表达。结果显示成功得到了PCGF1稳定敲低的MCF7细胞系转染 MCF7 细胞系。 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒.测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG,PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞.采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序,Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞.结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞.免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布.结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础. ESR1突变已经被证实与乳腺癌内分泌治疗耐药密切相关，在经过至少一线内分泌治疗的转移性乳腺癌患者中，ESR1 LBD突变的阳性率在54%左右，研究证实Y537S位点突变型ER的活性最高，并且近几年的研究发现ESR1 Y537S突变不仅对传统的内分泌治疗耐药，也会对最新的CDK4/6抑制剂产生耐药。 为了解决晚期转移性患者在化疗期间遇到的一系列问题，空军军医大学西京医院李南林教授与来自哈佛大学Dana-Farber Cancer Institute 的乳腺癌专家Rinath Jeselsohn开展合作，最终发现氟维司群联合化疗在ER阳性、P53野生型乳腺癌细胞系中具有协同效应，同时拥有ESR1 Y537S突变的细胞系具有更高的协同效应分数；细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡增加可能是这两种药物发挥协同作用的主要机制。因此，对于ESR1 Y537S突变、P53野生型的乳腺癌患者，氟维司群联合化疗或许可以发挥更好的作用，但仍需进一步动物实验和临床试验研究证实。 参考文献： 闫睿, 樊嵘, 董瓅瑾,等. 利用CRISPR/Cas9系统构建PCGF1基因敲除MCF7稳定细胞系[J]. 武警后勤学院学报(医学版), 2017(04):11-14. 高伟健, 朱一超, 郑幽,等. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系[J]. 生物技术通讯, 2020, ;(02):33-37+117. Huang M , J Wu, Ling R , et al. Quadruple negative breast cancer[J]. Breast Cancer, 2020, 27(4).
“上帝的手术刀”对海洋生物做了啥？ 今年的诺贝尔化学奖颁发给了两位女科学家——埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna），以表彰她们开发了被誉为“上帝的手术刀”“基因魔剪”的CRISPR/Cas9基因编辑技术。今年的诺贝尔化学奖得主 CRISPR即成簇的规律性间隔排列的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat ）。Cas是CRISPR关联基因（CRISPR associated gene）的缩写。 CRISPR最初由日本科学家在大肠杆菌中发现，后来被证明广泛存在于约45%的细菌和约90%的古细菌中，是其抵御噬菌体入侵的重要武器。 当噬菌体第一次侵染细菌时，细菌的Cas1和Cas2蛋白会将噬菌体的一小段DNA片段整合到自己的重复序列区中，成为一个新的间隔序列。待同一种噬菌体再次来袭时，病毒DNA被间隔序列转录的guide RNA识别，并激活Cas核酸酶，切断噬菌体的DNA双链，从而守护自身安全。利用此原理，科学家们可以实现对研究对象某一特定序列的靶向敲除、敲入等。CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9系统可分为三类，其中CRISPR/Cas9结构和操作更简洁，由guide RNA引导Cas9核酸内切酶进行靶向基因编辑，自2013年首次运用到真核生物基因编辑以来，发展迅速，曾于2013年、2015年两次被Science杂志评为当年十大科学突破，且今年终于不负众望，摘得诺奖桂冠。 目前关于CRISPR基因编辑技术的报道多集中于人类医学（处于实验室研究阶段）和线虫、拟南芥、果蝇、斑马鱼、小鼠等模式生物。那么，这把“上帝的手术刀”在海洋生物中的应用取得了哪些进展呢？构建海洋模式生物与疾病模型 将CRISPR基因编辑技术运用于海洋生物的最早报道可追溯至2014年。这一年，Sasaki、Stolfi等人均以海洋模式生物——玻璃海鞘（Ciona intestinalis）为研究对象，利用CRISPR技术先后实现了Hox基因定位和ebf基因定点突变。 Hox基因是一种动物基因组内高度保守的发育调控基因，在动物体轴形成过程中起重要的作用。ebf基因可在胚胎发育过程中决定细胞命运。这两种基因突变的玻璃海鞘模型可用于探究脊索动物身体形成的分子机制。 2016年，Nymark等将CRISPR技术运用到了海洋藻类中, 成功敲除了三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的CpSRP54基因。 CRISPR技术为海洋生物模型构建提供了新的视角，加快了科学家们探秘海洋生物起源与进化的步伐。培育海洋经济新品种 海产鱼虾贝蟹是我们饮食中重要的蛋白质来源，而良种的培育能促进海水养殖业快速发展。利用基因编辑技术在新品种培育中具有诸多优势，如育种周期短、靶向性强、比转基因技术安全性高等，有着广阔的应用前景。 2019年，Kim等将肌生成抑制素（PoMSTN）基因相关基因编辑组件通过显微注射导入牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎中，经过筛选，得到了杂合双等位基因突变体，表现为身体增厚，肉质更加肥满。与野生型（左）相比，PoMSTN基因杂合突变的牙鲆（右）的肥满度增加（图片来自Kim等，2019） 今年，来自河北大学的研究者们利用CRISPR/Cas9技术敲除了脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）的类胡萝卜素异构加氧酶（EcNinaB-X1）基因，发现突变体在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻击时存活率明显高于野生型；又敲除了另一个类胡萝卜素加氧酶基因EcBCO2，突变体具有更高的抗病性。这些研究发现为培育抗病抗逆对虾新品种提供了新思路。解析海洋生物基因功能 解密基因的功能是解读生命这部“天书”的先决条件，基因编辑技术为科学家们提供了一个解密的绝妙手段。2014 年，Nakanishi等人将CRISPR 技术首次运用于甲壳动物，失活了大型溞（Daphnia magna）的pax6 基因，证明了该基因在眼发育中的关键作用。2019年，Liu等人成功敲除海胆的聚酮化合物合酶1基因（Psk1），突变个体从表现为白化。野生型（左）与Pks1基因敲除的白化海胆（右）（从3个月至成年） 需要承认，基因编辑技术在海洋生物的应用仍处于初级阶段，受到海洋生物材料本身问题（如显微注射后的受精卵孵化率有待提高、海洋生物细胞系数目较少等）、CRISPR系统脱靶问题等方面的制约。但毫无疑问，海洋生物基因编辑领域的前途是光明的，我们有理由相信科研工作者们会不断创新，成功解决上述问题，取得海洋生物基因编辑领域的一个又一个成就！参考文献Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): J, Cho J Y, Kim J W, et al. CRISPR/Cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. Aquaculture, 2019, 512: D, Awazu A, Sakuma T, et al. Establishment of knockout adult sea urchins by using a CRISPR‐Cas9 system[J]. Development, Growth & Differentiation, 2019, 61(6): 378-388.
1. 细胞背景： HCT116细胞是由M·Brattain等人于1979年从一位患结直肠癌的48岁男性病人中分离得到的。该细胞在半固体琼脂糖培养基中形成克隆，在无胸腺裸鼠中有致瘤性，形成上皮样的肿瘤，属于上皮样贴壁生长的肿瘤细胞系。 2. 应用范围和前景： 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤中发病率位居第三，死亡率位居第二，根据 GLOBOCAN 数据显示，2018 年全球结直肠癌新增 185 万例，约 88 万人死亡，给人类健康带来了巨大威胁。[1]因此，研究结直肠癌的发病机制以及治疗手段对临床诊断和治疗结直肠癌具有十分重要的意义。目前，在药物开发的最初级阶段即细胞生物学水平的鉴定中，HCT166细胞已成为结直肠癌研究领域中被广泛使用的模式细胞，具体应用举例如下： （1） 探究药物影响结直肠癌细胞增殖，迁移和侵袭的机制。例如：PPARα在白霉素处理的HCT116细胞迁移活性及CYP2S1和CYP1B1的表达中起重要作用[2] （2） 探究药物影响结直肠癌细胞生长的体外作用机制，如细胞凋亡和细胞周期改变等。例如：Raddeanin A通过PI3K/AKT通路调控人HCT116细胞凋亡和周期阻滞[3] （3） 探究药物对结直肠癌治疗的敏感性和耐药性。例如：Doxorubicin抑制HCT116细胞中miR-140的表达而上调PD-L1，从而使肿瘤细胞对药物产生耐药性[4] （4） 开发新的癌相关信号通路，为临床治疗结直肠癌提供指导：例如，研究Notch和Wnt信号通路在结直肠癌细胞HCT116耐药中的意义等[5] （5） 开发LncRNA和miRNA在结直肠癌治疗中的新途径。例如：在HCT116细胞中，YWHAE长链非编码RNA通过激活K-Ras/Erk1/2和PI3K/Akt信号通路与miR-323a-3p和miR-532-5p竞争，为结直肠癌的治疗提供新的靶位点[6] 如上所述，HCT116细胞在结肠癌的各种机制都具有重要的研究价值，而最基本的研究思路一般都从分子层面即基因或蛋白开始，因此CRISPR/Cas9技术的身影也就理所当然地出现在许多研究课题中，毕竟它在研究致癌相关的单基因功能中有着无可替代的优势。 如发现TRPM4在人结直肠癌中高表达，似乎与结直肠癌细胞的增殖、细胞周期和侵袭有关，通过在HCT116细胞中利用CRISPR/Cas9技术对TRPM4基因敲除后发现肿瘤细胞的迁移和侵袭的确都降低了，同时伴随着细胞周期的改变[7]； 以及Cell报道利用CRISPR/Cas9技术，将野生型KRAS替换为突变型使得杂合突变的HCT116细胞对药物治疗更为敏感[8]； 再如利用CRISPR/Cas9技术对HCT116细胞中的Tks4基因敲除，表现出显著的上皮间质转化，细胞运动增加，细胞间的粘附程度降低，发现Tks4基因在EMT调控和肿瘤发展中发挥重要作用[9]； 发现CTC1L1142H突变导致端粒酶维持受损，研究人员利用CRISPR/Cas9技术对HCT116细胞中的CTC1点突变，证实了CTC1:STN1相互作用为抑制端粒酶活性所必需[10]。 可以看出，研究人员对于CRISPR/Cas9技术的青睐是毋庸置疑的，源井生物提供的CRISPR/Cas9技术服务也为众多科研人员解决了实验难题，如细胞基因敲除不彻底、细胞基因敲入不稳定等等，让更多科研人员能顺利实现他们的科研目标。 1. 基因点突变[11] Hiroyuki Kato等研究者利用CRISPR/Cas9技术在HCT116细胞中突变了UTX基因第137和138位氨基酸：G137V和 G137VΔ138，发现原本表达于细胞核的野生型UTX，在两种突变株的细胞核中表达量大大降低了，而在细胞质中的表达增加了，如图A-C所示：A,B为免疫荧光图片，C为Western Blot结果；免疫共沉淀的结果如图D所示，这是一种新的UTX调控机制，文章中还进一步揭示了UTX与MLL3/4复合物（ASH2L, PTIP and PA1是MLL3/4复合物的成分）相互作用在癌症形成中的重要性。 2. 基因敲除[12] Sara Steinmann等人利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了DAPK1缺失型的HCT116单克隆细胞系，最终揭示了DAPK1对结直肠癌侵袭性的影响。 经过Western Blot验证，Sara Steinmann等人得到了三种DAPK1基因敲除型单克隆细胞（如图A所示）。免疫荧光实验检测pERK1/2主要位于野生型HCT116细胞质，然而在三种基因敲除型细胞中，pERK1/2均在细胞核中显著表达。（如图B所示） 由于绒毛膜尿囊膜模型（CAM）实验是血管生成的经典体内模型，研究人员将DAPK1基因敲除型克隆和野生型HCT116细胞移植到鸡CAM上，并在蛋中培养5天，发现DAPK1的缺失导致CAM体内生长模式的改变和肿瘤出芽的增强(如图C所示) 此外，该研究团队利用大鼠脑3D体外模型发现肿瘤细胞在鸡胚胎器官中有更多的扩散，并且侵袭能力也增强了。DAPK缺失型HCT116细胞表现出更多的弥散性肿瘤细胞，并优先在鸡胚的肝、心、脑中积累（如图D所示）。最后，研究人员发现DAPK1-ERK1信号通路参与了CRC的转移过程(如图E所示)。 3. 基因敲入[13] Bax是促凋亡Bcl-2基因家族成员之一，在线粒体依赖的凋亡起始中发挥重要作用，R Peng等研究人员在BAX-KO HCT116细胞中敲入了5种位于Bax基因上且与Bcl-2其它成员有相互作用的突变位点。 已有文献报道BAX-KO HCT116细胞在一种甾醇类药物 sulindac的刺激下并不会发生凋亡，而R Peng等研究人员发现在BAX-KO HCT116细胞中敲入WT BAX能恢复sulindac和TRAIL引起的HCT116细胞凋亡；敲入K21E和D33A突变，Bax介导的凋亡被完全恢； 敲入D68R和 S184V突变只恢复了一部分，而敲入L70A/D71A突变恢复药物引起的凋亡程度更低。 该研究是在目的基因敲除了的目的细胞的基础上，再进行含有突变位点的目的基因敲入以及WT目的基因敲入（作为对照），便可清晰地了解目的基因表达的蛋白和与之相互作用的其它蛋白间相互作用的特定位点关系，是一个验证通过生物信息学分析得到的预测位点是否在蛋白质相互作用中真实起作用的好方法。因此，源井生物也为科研人员提供了相应的服务便利，在享受细胞基因敲入服务的同时，还会得到我们赠送的基因敲除细胞，满足科研人员的各种研究需求。 参考文献 : [1] Bray, Freddie et al. “Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.” CA: a cancer journal for cliniciansvol. 68,6 (2018): 394-424. doi:[2] Khor CY, Khoo BY. PPARα plays an important role in the migration activity, and the expression of CYP2S1 and CYP1B1 in chrysin-treated HCT116 cells. Biotechnol Lett. 2020;42(8):1581-1595. doi: [3] Meng C, Teng Y, Jiang X. Raddeanin A Induces Apoptosis and Cycle Arrest in Human HCT116 Cells through PI3K/AKT Pathway Regulation In Vitro and In Vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:7457105. Published 2019 May 26. doi: [4] Naba NM, Tolay N, Erman B, Sayi Yazgan A. Doxorubicin inhibits miR-140 expression and upregulates PD-L1 expression in HCT116 cells, opposite to its effects on MDA-MB-231 cells. Turk J Biol. 2020;44(1):15-23. 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自 20 世纪 70 年代末开始，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势。美国女性乳腺癌的患病率高达。中国虽然不是乳腺癌的高发国家，但是近年来我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家 1～2 个百分点。同时，在卫计委公布的 2013 年年鉴中显示，我国在2004年到2005年间，乳腺癌的已经成为女性死亡率最高的生殖系统肿瘤。甚至有研究表明，现在在中国，与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症。 多梳基因家族（polycomb group，PcG）蛋白PcG是一类表观遗传抑制因子，包括PRC1和PRC2两大复合物，在决定细胞命运以及肿瘤发生等方面发挥重要作用。PCGF1是多梳基因家族PRC1复合体的重要组成部分，该复合体主要包括PCGF蛋白、CBX蛋白，RING1蛋白和HPH蛋白。 前期研究发现PCGF1在多种肿瘤细胞中表达丰度较高，尤其以乳腺癌细胞和胶质瘤细胞表达尤为明显。以PCGF1序列为模板，设计sgRNA干扰序列，两端加入载体连接序列。通过DNA片段合成所需sgRNA序列。退火形成oligo二聚体序列后，使用T4 DNA连接酶重组干扰序列与pCAG-T7-Cas9-pgk-Puro-T2A-GFP质粒，最终成功构建 PCGF1 敲低载体。将pCAG-T7-Cas9-gRNA-pgk-Puro-T2AGFP重组载体通过脂质体转染MCF7细胞系。通过嘌呤霉素进行阳性克隆筛选，Western blotting检测PCGF1表达。结果显示成功得到了PCGF1稳定敲低的MCF7细胞系转染 MCF7 细胞系。 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒.测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG,PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞.采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序,Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞.结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞.免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布.结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础. ESR1突变已经被证实与乳腺癌内分泌治疗耐药密切相关，在经过至少一线内分泌治疗的转移性乳腺癌患者中，ESR1 LBD突变的阳性率在54%左右，研究证实Y537S位点突变型ER的活性最高，并且近几年的研究发现ESR1 Y537S突变不仅对传统的内分泌治疗耐药，也会对最新的CDK4/6抑制剂产生耐药。 为了解决晚期转移性患者在化疗期间遇到的一系列问题，空军军医大学西京医院李南林教授与来自哈佛大学Dana-Farber Cancer Institute 的乳腺癌专家Rinath Jeselsohn开展合作，最终发现氟维司群联合化疗在ER阳性、P53野生型乳腺癌细胞系中具有协同效应，同时拥有ESR1 Y537S突变的细胞系具有更高的协同效应分数；细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡增加可能是这两种药物发挥协同作用的主要机制。因此，对于ESR1 Y537S突变、P53野生型的乳腺癌患者，氟维司群联合化疗或许可以发挥更好的作用，但仍需进一步动物实验和临床试验研究证实。 参考文献： 闫睿, 樊嵘, 董瓅瑾,等. 利用CRISPR/Cas9系统构建PCGF1基因敲除MCF7稳定细胞系[J]. 武警后勤学院学报(医学版), 2017(04):11-14. 高伟健, 朱一超, 郑幽,等. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系[J]. 生物技术通讯, 2020, ;(02):33-37+117. Huang M , J Wu, Ling R , et al. Quadruple negative breast cancer[J]. Breast Cancer, 2020, 27(4).
CRISPR-Cas9是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，短短几年内,CRISPR-Cas9技术风靡全球, 成为现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，成为当今最主流的基因编辑系统。
一、什么是CRISPR-Cas系统
CRISPR-Cas系统是原核生物的一种天然免疫系统 。某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA 里一个称为 CRISPR 的存储空间。当再次遇到病毒入侵时，细菌能够根据存写的片段识别病毒，将病毒的DNA切断而使之失效。
C RISPR-Cas系统包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR关联基因）两部分。
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1、CRISPR（/'krɪspər/）是原核生物基因组内的一段重复序列 。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）。分布在40%的已测序细菌和90%的已测序古细菌当中。 （注：生活在深海的火山口、陆地的热泉以及盐碱湖等极端环境中，有一些独特结构的细菌，称为古细菌）
CRISPR基因序列主要由前导序列（leader）、重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）构成 。
①前导序列 ：富含AT碱基，位于CRISPR基因上游， 被认为是CRISPR序列的启动子 。
②重复序列 ：长度约20–50 bp碱基且包含5–7 bp回文序列，转录产物可以形成发卡结构， 稳定RNA的整体二级结构 。
③间隔序列 ： 是被细菌俘获的外源DNA序列 。这就相当于细菌免疫系统的“黑名单”，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。
2、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（ CRISPR associated，Cas ）。
Cas基因编码的Cas蛋白在防御过程中至关重要，目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。
依据Cas蛋白在细菌免疫防御过程中参与的角色，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类。
第一大类 ：它们切割外源核酸的效应因子为多个Cas蛋白形成的复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型。
第二大类 ：它们的作用因子是比较单一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白。
目前，被最为广泛应用的CRISPR系统是II型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。
二、CRISPR-Cas9的作用原理
对于CRISPR-Cas9的作用机理可以分为三个阶段来理解。
1、第一阶段：CRISPR 的高度可变的间隔区的获得 （ 俘获外源DNA，登记“黑名单” ）
CRISPR 的高度可变的间隔区获得，其实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的两个重复序列之间。因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从5' 到3' 的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间顺序。
新间隔序列的获得可能分为三步：
第1步：Cas1和Cas2编码的蛋白将扫描入侵的DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原型间隔序列。
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第2步：Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。
第3步：DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。
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2、第二阶段：CRIPSR 基因座的表达（包括转录和转录后的成熟加工）
CRISPR序列在前导区的调控下转录产生pre-crRNA（ crRNA的前体 ），同时与pre-crRNA序列互补的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被转录出来。pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。它将根据入侵者的类型，选取对应的“身份证号码”（ 间隔序列RNA ），并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的协助下对这段“身份证”进行剪切，最终形成一段短小的crRNA（ 包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区 ）。
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物，为下一步剪切做好准备。
3、第三阶段：CRISPR/Cas 系统活性的发挥（靶向干扰）
crRNA，Cas9以及tracrRNA组成最终的复合物就像是一枚制导导弹，可以对入侵者的DNA进行精确的打击。这个复合物将扫描整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。
随后，Cas9蛋白精确的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默，入侵者被一举歼灭。
三、 CRISPR-Cas9基因编辑技术及应用…
tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（sgRNA）时也可以发挥指导Cas9的作用。
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA（guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
CRISPR-Cas9的广泛应用
1、基因敲除（Knock-out）
Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的 非同源末端连接 方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，（ 移码突变 ：是指DNA分子由于某位点碱基的缺失或插入，引起阅读框架变化，造成下游的一系列密码改变，使原来编码某种肽链的基因变成编码另一种完全不同的肽链序列。）使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除
2、基因敲入（Knock-in）
当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行 同源重组修复 （HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率
3、基因抑制、基因激活（Repression or Activation）
Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9 nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。
4、多重编辑（Multiplex Editing）
将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。
5、功能基因组筛选
利用CRISPR-Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP-Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。 CRISPR-Cas9基因编辑技术简介 - 知乎 ()
基本原理
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。
前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。
重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。
工作原理
当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长得RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。
CRISPR基因编辑技术，常被比作“基因剪刀”。
CRISPR（/'krɪspər/，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器。
简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统。
利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统，是古菌和细菌抵抗病毒等外源遗传物质入侵的一种获得性免疫系统。
微生物学家掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。
许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。
这种技术被称为CRISPR/Cas基因编辑系统，迅速成为生命科学最热门的技术。该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。
2018年2月，专家预测称，这种基因编辑技术将改变我们的星球，改变我们生活的社会和周围的生物。
基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。
这是运用了好梦技术做到的，有了这样的技术。所以可以运用它们的工具，医生只手操作就可以看到结果。
我之前碰到过类似的问题，总结一下就是，基因编辑的原理的确是基因突变，不是基因重组。基因编辑是比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰（改变几个碱基之类的）；转基因技术才是基因重组（将特定的外源目的基因转移到受体生物中）。
"公众对转基因担心的并不是基因技术，关键是转基因的“转”，现在通过基因测序研究已发展出基因编辑技术，可根据需要对原来的基因进行重新编辑，它可以不转任何新的基因，也能产生很好效果。中国今后将在进一步开展转基因研究的同时，积极推动基因编辑技术研究"。大妈连基因编辑都知道，真是厉害啊。既然提到这个，我就来科普一下啦。这个技术被Science期刊列为2013年十大突破中的第二位。导引RNA-Cas9系统是目前最简单有效的基因编辑方法。这个系统本身最初是受细菌抵抗噬菌体的启发。理论上你可以合成跟任何基因的DNA互补的导引RNA，这个RNA通过DNA-RNA序列互补（碱基配对），把核酸酶Cas9定位到目标基因，然后Cas9利用它的核酸酶活性把目标基因在特定的部位切断。之后，细胞自身的DNA损伤修复机制可以被用来改变目标基因Cas9切割点附近的DNA序列。这个系统可以用来选择性剔除某个基因，控制目标基因的转录活性，甚至有可能用来纠正导致遗传性疾病的突变基因。可是说到底，这个系统还是需要导入外源蛋白Cas9（最常用的是来自链球菌的Cas9)。另外，基因编辑只是对内源（原有）基因的修饰，而作物之所以需要转基因，常常是因为它们的内源基因里面没有包括编码某些有益性状的基因。如果要把内源的某个基因就地变成一个新的基因，即使技术上可以做到，带来的坏处也很可能超过好处（当然在特定条件下可能有例外），因为这个基因就会失去了原来该有的功能。当然，在有的情况下，可以利用基因编辑技术改变基因组里面某些基因的表达水平，就可以加强某些有益的性状和减弱某些有害性状。总之反转跟信教一样，是一种思维定式，基本上无解，不是技术手段可以解决的问题。
晕，怎么都是关于这样的文章，我都回答4道了。内容：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。 从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间限制，扩大和带来了定向创造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。 基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 基因工程要素：包括外源DNA，载体分子，工具酶和受体细胞等。 一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。 以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。忘了问一下，是多少字的论文。（希望能采纳，一个字一个字打进去的，没有功劳也有苦劳）
转基因技术是通过有性生殖过程实现的，作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活。面是我整理的关于转基因技术论文，希望能对大家有所帮助!转基因技术论文篇一：《试谈转基因技术》 【摘要】 作为生命科学的前沿技术，转基因技术已经逐渐走入了人们的生活，应用领域不断开拓，在解决人类所面临的粮食短缺、环境污染、资源匮乏、效益衰减等重大问题上显示出日益重要的作用, 逐渐发展成为强大的现代生物技术产业。然而，由于转基因生物及其产品是否存在潜在风险尚无定论，故转基因生物及其产品的安全性成为全球的 热点 问题，并引起世界各国政府和许多国际组织的高度重视。 【关键词】转基因技术;发展现状;争议;生物安全管理 1 转基因技术简介 转基因技术(Transgene technology)是指根据人们的意愿，利用分子生物学 方法 ， 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的 同义词 。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"(Genetically modified organism，简称GMO)。 转基因技术的优越性体现在：首先，转基因技术突破了传统技术的某些局限，其所转移的基因不受生物体间亲缘关系的限制，比如将人类的胰岛素基因导入到细菌体内，跨越了物种之间的界限。其次，转基因技术所操作和转移的一般是经过明确定义的基因，功能清楚，后代表现可准确预期。因此，转基因技术对传统的育种技术进行了广泛的发展和比较完美的补充。 2 转基因技术方法 植物转基因方法。 转基因植物是指利用重组DNA技术将克隆的优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得的具有新的遗传性状的植物。方法有如下几种： 农杆菌介导法：农杆菌中有一种致瘤的环型DNA，称为Ti质粒。被农杆菌感染的植物之所以长瘤正是由于T―DNA插入了植物染色体。从此，人们便利用这种天然的转化体系向植物转基因。 基因枪：利用火药爆炸或高压气体加速(这一加速设备被称为基因枪)，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出植株，选出其中转基因阳性植株即为转基因植株。主要优点是不受受体植物范围的限制。而且其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。 花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 动物转基因方法。 转基因动物是通过人工实验方法，将别的基因导入动物细胞，与动物本身的基因整合在一起，并随细胞的分裂而繁殖，并且能够将别的基因信息遗传给后代，严格意义上说，转基因动物是人工创造的新动物。 转基因动物接受外来基因的细胞一般是受精卵。主要的转基因动物技术包括有： 核显微注射法：是动物转基因技术中最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，最后移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。它可以直接获得纯系，实验周期短。 逆转录病毒载体法：指将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。此法优点在于无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝;将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。 胚胎干细胞介导法：是将基因导入胚胎于细胞;然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外选择一个特殊的基因型，用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到很多遗传上相同的转基因动物。 3 转基因技术发展现状 目前，国际上获得的转基因植物已达100种以上。转基因作物已在美国、阿根廷及加拿大等国大面积 种植 ，在所有转基因作物中，转基因的大豆、玉米、棉花和油菜的种植面积占99%以上。中国政府十分重视生物技术的研究，中国正在研发的转基因作物和林木有47种，涉及的基因种类超过100种。以转基因山羊、奶牛生产LAt-PA，以转基因猪生产人血红蛋白等，这些基因产品具有高效、优质、廉价与相应的人体蛋白具有同样的生物活性，且多随乳汁分泌，便于分离纯化。 4 转基因技术的争议 随着转基因问题日益成为热点，越来越多的人开始关注转基因。科学家发明转基因技术的初衷是想利用该技术造福人类，既可加快农作物和家畜品种的改良速度，提高人类食物的品质，又可以生产珍贵的药用蛋白，为患病者带来福音。 但是，人类对自然界的干预是否会造成潜在的尚不可能预知的危险?由于一系列的争论，联合国也公开言论试图说明转基因产品是无害安全的，国际经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则，如果转基因动植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。然而各国政府对于转基因的态度却转向两个方向。一方是以美国为代表的宽松政策，认为只要在科学上无法证明转基因产品的危害性都不应该限制。另一方以欧盟为代表的则认为只要不能否定其危害性就应该限定。 我国政府十分重视转基因生物安全管理问题，2001年5月，国务院颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，我国越来越重视转基因生物及其产品的安全性，并且密切关注国际上有关管理法规的动向。 转基因技术论文篇二：《试论转基因食品检测技术》 摘要：在基因工程技术开展的影响下，各国对转基因食品的研发也在不时放慢，而转基因食品的呈现随同着食品平安成绩，人们对转基因食品的信任度并不高，为了使人们可以对转基因食品停止自主选择，各个国度与组织机构要求企业对消费的转基因产品停止标识，这也对转基因食品剖析检测技术提出了更高的要求。本文引见了转基因食品剖析检测技术的内容，讨论其研讨进程，并对转基因食品剖析检测技术的将来开展停止了瞻望。 关键词：转基因食品;剖析检测技术;基因工程 20世纪70年代重组DNA技术的问世将生物技术带进基因工程时代，农业生物技术在世界范围内迅速崛起，转基因动物在全球范围内失掉普遍种植，随之而来的转基因食品也迅猛开展。由于转基因生物技术的普遍使用和转基因作物的大规模种植，转基因食品的平安性成绩也已惹起人们越来越多的关注。 一、转基因食品标识制度与剖析检测技术 我国在2015年对叶食品平安法曳的修订中有明白的指示，企业对转基因食品必需依照规则停止标识。目前国际中关于转基因食品标识制度次要分为强迫性标识与自愿性标识2种。在我国关于转基因食品的标识有着较为严厉的法律制度，关于企业消费与运营的产品直达基因食品含量超越阈值必需停止标识。而在一些欧美国度对转基因食品标识没有严厉的要求，只关于存有过敏要素的转基因食品停止标志。而在我国产品出口时需求停止严厉的剖析检测，关于合格的转基因食品同意出口并停止转基因标识，其也是产品流通的关键。由此可见标识的重要性[1]。而对转基因产品的标识需求经过剖析检测来完成，故转基因食品标识制度是转基因食品的重要标签。实践检测才能决议标识制度的树立，定性和定量剖析检测技术所到达的检测限为标识制度提供迷信根据;但是在实践检验检疫任务中标识制度是经过检测技术来完成的。因而，标识制度与剖析检测技术的关系非常亲密，二者互相影响，互相作用[2]。 二、、转基因食品成绩现状 转基因食品概述 在基因工程中，应用DNA重组技术将外源性基因转移到其他生物体中，使生物体显现出特殊的遗传特征与生物性状，失掉新的基因重组的生物体就是转基因的内容。而所谓转基因食品则是使用这些特殊的生物体停止加工而成的食品。转基因在某种水平上只是应用外源性基因放慢生物体的生出息程，在基因工程中，转基因食品次要是为了延长作物生长周期尧添加作物产量尧添加抗病虫害才能，从而无效降低消费本钱，进步作物的消费效益。在目前的转基因研讨中，并没有发现食品中含有少量的毒素。但是由于转基因食品属于人工制造的外来生物体而非自然选择生成的物种，在基因漂流的进程中发生的基因序列的改动无法完全地停止掌握，外源性基因在与DNA停止重组时存在着不可控制的性状，因此对转基因食品的平安性也无法停止确切的定论[3]。 转基因食品存在的成绩 转基因食品自呈现开端便成了一种十分具有争议的食品，越来越多的转基因食品流入市场与媒体的发酵使人们对转基因食品的平安性有了很大的质疑。而在转基因食品平安的成绩上，目前还没有严谨的迷信结论与研讨 报告 对其平安性给出确切的证据结论，其存在的成绩次要有以下几个方面。第一，转基因食品是由基因植入及基因重组构成的新的生物体，其本来具有的构造与成分能否发作了变化;第二，转基因食品不是自然界生成的产物，食用转基因食品能否会对人体发生负面影响，临时食用能否会有毒素的积聚，对人体的发育生长有什麼影响;第三，转基因作物不是在自然选择下呈现的产物，其能否会对生物链有影响，能否会毁坏生态均衡;第四，转基因作物是基因活动下的产物，这种状况下能否会呈现基因净化的状况，涉及到其他自然界的作物，使其基因发作改动[4]。由于上述这些成绩并没有失掉无效的处理，因此才迫切需求完好尧精确尧严谨的转基因食品剖析检测技术对其平安性停止保证，从而进一步完善我国转基因食品监管方面的迷信标准。 转基因食品检测技术的内容和分类 目前，关于转基因食品的平安性次要依托转基因食品剖析检测来停止测定。而在转基因食品的剖析检测进程中，次要是对DNA尧蛋白质及核酸这3类物质停止测定，可以依据这3类物质分红3个品种的检测办法，在实践状况中可以依据需求停止检测办法的联用。由于蛋白质程度检测办法仅适用于未停止加工的食品检测和新颖食品范围，具有较大的局限性，因此现阶段外源基因测定办法的运用范围较为普遍[5]。 三、转基因食品检测技术的研讨 蛋白质印迹检测技术 蛋白质印迹检测次要是应用聚丙烯酰氨凝胶电泳对转基因食品外源蛋白质停止别离，并与显色酶反响停止结合，从而使外源蛋白质可以无效地停止别离检测。这种检测办法次要是对转基因食品中不可溶蛋白质停止剖析，检测在转基因食品中的蛋白质含量，并与蛋白质预定限值停止比对。 复合扩增PCR检测技术 目前在转基因食品检测中多重PCR检测技术是一种被普遍运用的检测手腕。PCR渊聚合酶链式反响冤普通只能对1个DNA片段停止缩小扩增检测。为了能在转基因食品检测中取得更片面的基因序列信息，在停止基因检测时应用PCR反响原理停止多重检测，由此构成了复合扩增PCR转基因食品检测技术。这种检测技术的使用可以无效提升检测效率，并且可以对基因序列多个靶位点同时停止检测，完成转基因食品检测的精确性与牢靠性[6]。 外源DNA检测技术 转基因食品次要是将外源DNA导入生物体中，而对外源DNA的检测次要是对植入的DNA片段停止转基因食品基因序列特征的检测，以转基因食品DNA序列作为检测目的，转基因食品核酸程度检测作为最次要的转基因产品检测技术，其次要检测启动子尧基因和终止子，便于检测转基因食品。 基因芯片检测技术 基因芯片是对转基因生物体的基因组序列停止测定，经过将转基因食品的DNA有规律排布在硅片或是玻片上构成微距阵。经过对基因芯片上的基因序列停止计算机软件的计算处置，从而取得转基因食品的基因特征与生物信息，这种办法可以精确无效地对转基因生物体的基因表达特征停止检测[7-9]。 检测技术 LAMP渊环介导等温扩增冤技术是众多核苷酸扩增技术中的一种，这种技术在运用时没有特定的环境条件要求，只需求在恒温形态下就可以停止检测实验，操作技术较为复杂。LAMP检测技术次要是应用显色反响对转基因生物体停止察看，并且应用浊度仪对其在反响进程中发生的沉淀物停止检测判别，是一种较为复杂的检测技术。 联用检测技术 联用检测技术次要是集合多种检测技术的优点对转基因食品停止无效的剖析检测，这样可以起到扬长避短的作用。在基因检测中，现有的联用检测技术有PCR技术与酶联免疫吸附法的结合运用等办法[10-11]。 四、结语 转基因食品剖析检测技术次要是对转基因食品的平安停止评价。目前，转基因食品剖析检测技术有多种，由于转基因食品的基因片段不同，因此采用的检测技术也需求根据实践需求停止选择，确保检测技术的无效性。在将来市场上会呈现越来越多的转基因食品，剖析检测技术作为其中重要的检测手腕也肯定会有新的开展。 转基因技术论文篇三：《浅议转基因食品消费者知情权保护制度》 [摘 要]转基因食品消费中存在的信息不对称及食品安全的不确定性引发了消费者的普遍关注，切实保障消费者的知情权有助于转基因食品的理性消费和转基因技术的健康发展。 因此，应借鉴美国和欧盟保障消费者知情权的主要制度，从标识制度、安全评价和检测制度以及公众参与制度等方面构建和完善我国转基因食品消费者知情权的保障体系。 [关键词]转基因食品;消费者;知情权。 二十世纪末以来，转基因食品在生活中得到了广泛的推广。 所谓转基因，就是利用分子生物学手段，将某些生物的基因转移到其他生物物种中去，使其出现原物种不具有的性状或产物，以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。但另一方面，随着转基因技术日益普遍的运用，这一技术对人类健康可能带来的安全隐患也逐渐受到社会各界的关注。在转基因食品已经生产并上市的情况下，消费者的知情权具有正当性，应当予以保护。 一、消费者知情权的内涵。 消费者有权要求经营者按照法律规定的方式标明转基因食品及其相关服务的真实成份、所用原料、来源。如果食品含有转基因成份、所用原料为转基因产品、直接来自于转基因方法培育的作物、所提供的餐饮服务中涉及转基因食品等等，则消费者有权要求经营者在出售转基因食品或提供转基因食品相关的服务时，予以标明。消费者有权在交易过程中，就所售食品或所提供服务进行询问和了解，经营者应该耐心、细致地予以回答和说明。经营者在提供转基因食品或与转基因食品相关的服务时，无论食品或服务的优、缺点均应向消费者如实介绍。 二、消费者知情权保护制度的意义。 (一)转基因食品消费者知情权保护，是食品安全保障的重要方面。 由于转基因作物能更好地防治病虫害，抵御干旱，提高产量，营养成分高，因此发展前景十分广阔。但专家们也强调，发展转基因食品必须有严格监督、科学检验、加强立法和管理，以避免它对人类健康和环境造成损害。[1]而转基因食品消费者知情权保护法律制度，有助于通过消费者监督，促使食品生产者在转基因技术的运用上更加慎重，避免有害健康的食品进入消费领域，因而是食品安全保障的重要途径和手段。 (二)转基因食品消费者知情权保护，是消费者权益的重要体现。 知情权作为政治民主化的一种必要和结果，是公民依法享有的基本人身权利。消费者作为特定的民事主体，其享有知情权是政治领域的民主原则扩展到经济生活的必然要求，我国相关法律法规做出了明确规定。特别是消费者的知情权，还是其行使选择权的前提条件，消费者有权决定是否购买转基因食品。因而知情权对食品消费者的基本权益的全面实现有着至关重要的作用。然而，就目前我国转基因食品研发、生产、加工、销售等方面而言，消费者所应享有的知情权与社会现实有着极大差距，现行法律对此方面规定亦不完善。这种情况不利于对消费者基本权益的保护，也对转基因食品的规范管理造成负面影响。 三、国外转基因食品消费者知情权保护现状。 转基因食品信息公开，保障消费者充分享有知情权，是目前世界各国自转基因生物技术研发到转基因食品商业化生产销售过程中所需解决的重要课题。欧美等发达国家对于此有着较为完善的立法和管理体系。国外先进的信息透明化管理模式以及消费者知情权保护法律制度的研究与实践对我国有着重大的借鉴意义。其主要可归纳为三大模式： (一)以欧盟为代表的严格限制型模式。 欧盟对转基因食品的认定根据过程而非最终产品。为保证消费者对食品拥有充分知情权，欧盟设立了专门机构，即欧盟食品安全管理局(EFSA)，负责评估与整个食物链相关的风险，不受其他机构管辖，独立开展工作。[2]并建立专门网站向公众提示食品风险问题，充分公开转基因食品自研发到销售的各环节信息。 在对消费者知情权法律保护方面，欧盟以《通用食品法》为主体，辅以大量食品标签法令和 广告 法令，构成高低有序，结构严谨的转基因食品信息公开制度。2003 年第 1829 号法令和1830 号法令规定：无论源自转基因生物的 DNA或蛋白质是否存在，只要食品包含转基因生物或由转基因生物制成，都要有特别标签加以标明。法令细化到标签规格制式，转基因含量限制等，种类扩展到数十类百余种。 (二)以美国为代表的宽松鼓励型模式。 美国对于转基因食品管理遵循的是“可靠性科学原则”，采取宽松式管理模式，奉行自律管制。但其仍十分注重公众知情权的法律保护，强调转基因技术研发、实践、生产、推广的透明性，并建立了有效的食品安全信息系统，定时发布转基因食品检测信息，在网络发布转基因食品名录、食品安全资源信息等，使食品安全信息最大限度予以公开。[3]美国《转基因食品安全管理草案》、《公共健康卫生法》、《联邦食品及药物管理现代化法》规定了转基因食品商业化申请流程，并将对公众公开相关技术资料等，作为取得食品和药物管理局(FDA)合法执照的必要条件。 (三)以日本为代表的折中模式日本对转基因食品采取的是在严格管制的同时加以鼓励的原则。为保护消费者知情权，日本政府颁布《转基因食品标识法》，对主要原料为已通过安全评价的转基因农产品，加工后仍残留重组 DNA或其编码的蛋白质食品，制定具体的标识办法。同时，由日本科学技术厅、农林水产省和厚生省共同管理转基因技术事项，定期公布转基因食品研发资料以及市场流通转基因食品名录。 国外转基因食品管理模式，不管其对转基因技术产品是否持谨慎态度，都将信息透明化、保证消费者充分知情权置于立法及管理优先考虑的方面，值得我国相关立法执法机构借鉴。 四、我国转基因食品消费者知情权保护现状。 我国政府高度关注现代生物技术，支持和鼓励转基因生物和转基因食品的研究。我国于 2000 年 8 月 8 日签署《卡塔赫纳生物安全议定书》的第 23 条规定：各缔约方应按其各自的法律规章，在关于改性活生物体的决策过程中征求公众的意见，并在不违反关于机密资料的情况下，向公众通报;缔约方应力求使公众知悉可通过何种方式公开获得生物安全资料。[4]2001 年 5月 23 日，国务院发布《农业转基因生物安全管理条例》，明确规定农业转基因生物实行安全评价制度，标志管理制度，生产许可制度，经营许可制度和安全审批制度。作为迄今为止我国级别最高、最全面的转基因技术管理条例，信息公开制度和知情权保护制度均未列入其中。 我国在转基因食品消费者知情权的保护方面在立法上取得重大成就的同时，也存在着一些弊端。如缺少专门生物技术安全立法，立法层次不高，研究、生产、销售等转基因技术重要阶段信息公开出现“真空管理”，[5]造成信息公开制度和知情同意制度严重缺失。转基因食品强制标识是保护消费者知情权最重要的手段，但随着转基因技术迅速发展，《农业转基因生物标识管理办法》所规定标识种类未进行更新补充，标识管理未向烟酒等进行细化规范，造成标识混乱，透露信息极为有限，对消费者充分行使知情权造成巨大阻碍。 五、完善我国转基因食品消费者知情权保护制度 措施 。 我国学术界在转基因食品消费者知情权法律保护方面，也做了较多的研究。具体来说，完善我国转基因食品消费者知情权保护制度，应加强以下三个工作重点： 第一，加强对转基因食品的标识管理。虽然转基因标识制度已经实施多年， 但在转基因食品标识上还存在诸多问题。一方面， 还有众多转基因食品没有进行标识;另一方面， 现有的进行了标识的转基因食品，其所作的标识多数不符合规范。因此，国家相关部门应在今后加强对转基因食品标识的监管工作。 第二，强调公众对转基因食品的知情权和选择权。公众对所消费的食品应拥有知情权和选择权， 公众只有充分地获得知情权， 才能享有选择权， 并最大限度地保护自己的权益。在目前转基因食品的风险和危害尚不明确的情况下， 消费者对其选择有些茫然难以避免。因此， 政府相关主管部门应提高转基因相关信息透明性和安全管理的公众可参与性， 比如在批准转基因生物环境释放和商业化生产时增加公众听证的程序。 第三，健全转基因食品检测、评估体系。首先， 建立独立的权威检测机构， 对转基因食品进行严格的检测， 保证其质量和安全性， 并逐渐形成一个覆盖全国的农业生物技术管理监督与监测网络体系。定时发布转基因食品名录供消费者参考。其次，严格控制转基因食品的生产、加工、贮运、销售直到进出口各环节， 使安全风险降至最低。[6]结合我国实际， 研制出一套切实可行的转基因食品安全评估体系， 将转基因食品置于规范化的管理和监控之中， 使消费者能放心地消费转基因食品。第三， 要加大执法力度。对未经申报审批而进行商业化生产的， 对不执行转基因食品标识制度的单位和个人， 应承担相应的法律责任，以保证转基因食品市场健康发展。 六、结语。