本文来源 “撤稿快讯” 官微
2019年6月，中国人民解放军总医院、内蒙古民族大学附属医院在 Molecular Therapy - Nucleic Acids （IF ） 发表题为 “Long Non-coding RNA PVT1 Competitively Binds MicroRNA-424-5p to Regulate CARM1 in Radiosensitivity of Non-Small-Cell Lung Cancer” （长链非编码RNA PVT1竞争性结合MicroRNA-424-5p调控CARM1对非小细胞肺癌的放射敏感性）的论文。
论文作者：第一作者：中国人民解放军总医院、内蒙古民族大学附属医院肿瘤科Dong Wang（音译 王东）；通讯作者：中国人民解放军总医院肿瘤内科Yi Hu（音译 胡毅）。
本文自2019年正式发表后，有读者质疑本文S9A/C的细胞周期图疑似为手绘；S8A/B中的细胞图与多篇文章存在重叠。针对以上质疑，作者尚未做出回复。
本文于2022 年 5 月 19 日被撤回 。撤稿说明显示：
应 Molecular Therapy – Nucleic Acids 编辑的要求，本文已撤稿。
在与读者提出的造纸厂一起调查数据制造问题时，发现本文图 S8A 和 S8B 中以相同或更改方式复制图像的证据。 这种在没有适当归属的情况下重复使用（部分是歪曲）数据代表了对科学出版系统的严重滥用。 就撤稿事宜联系作者时，作者没有回应。
参考信息：
本文来源 “撤稿快讯” 官微
生物通报道：长非编码RNA（lncRNA）长达两百个核苷酸以上的转录本，但并不编码任何蛋白质。尽管如此，长非编码RNA在不同组织和发育阶段的表达依然具有特异性，说明lncRNA的调控具有重要的生物学意义。细胞中绝大多数lncRNA（也称lincRNA）位于细胞核，它们对应的DNA区域有的与蛋白编码基因重叠，有的位于基因间或者内含子中。为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢？这些RNA分子究竟有何功能？RNA测序技术的发展使人们得以初窥这一神秘的分子，现在lncRNA的许多相关信息都可以在新数据库中查到，例如Broad研究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的Human Body Map lincRNAs catalog。不过现在人们了解到的lncRNA只是冰山一角，还有大量lncRNA的功能有待科学家们去探寻。lncRNA研究工具现在lncRNA研究面临的一个主要挑战是，研究工具还在不断开发和改进中，其中包括设计带有不同lncRNA检测探针的芯片。安捷伦公司的SurePrint G3 Gene Expression v2 microarray就是其中之一，该芯片的探针设计不仅参照主要公共数据库中的mRNA，还参照了Broad研究所开发的lincRNA和TUCP（transcripts of uncertain coding potential）数据库，可以同时检测编码RNA和非编码RNA。据安捷伦公司基因表达产品经理Corinna Nunn介绍，lncRNA的表达水平比编码RNA低，“因此芯片的动态范围宽很重要，这样才能够保证检测到表达水平较低的基因。”Affymetrix也推出了新版人类全转录本表达谱芯片GeneChip® Gene ST Arrays，能够在一张芯片上同时检测mRNA和lincRNA。该芯片的设计结合了多个数据库资源，包括RefSeq、Ensemble、Broad研究所的Human Body Map lincRNAs和TUCP catalog。 “我们的超高密度芯片具有独特的探针，能够检测每个转录本各外显子上的多个位点，确保最大程度的捕捉相关生物学信息，” Affymetrix公司的Tsetska Takova说。生物通 Arraystar公司自2009年就开始设计lncRNA芯片，近日该公司刚刚发布了可同时检测mRNA和lncRNA的的第三代lncRNA芯片Human LncRNA Microarray 。Arraystar的技术支持专员Ed Davis介绍说，表达谱往往是研究lncRNA的第一步，不过开发lncRNA表达芯片仍然比较复杂，其中多个lncRNA数据库并存就是一个复杂因素。“为此，我们将公共数据库与重要lncRNA论文中的信息结合起来，建立了一个可靠的综合性lncRNA数据库，” Davis说。此外设计lncRNA探针也并不容易，因为lncRNA常常与附近的蛋白质编码基因重叠。Davis介绍道，“传统芯片探针是‘基因特异性的’，换句话说就是探针靶标转录本的3’端，因此无法区分转录起始位点或剪切方式可变所形成的多种转录本。但Arraystar的探针是‘转录本特异性的’，能够靶标外显子和剪接点，检测到单个基因的不同转录本。”lncRNA的功能阐明lncRNA的功能并不容易，Davis介绍道“与microRNA不同， lncRNA能通过多种机制起作用，而且很难依据其序列来推断其功能。” 据Affymetrix公司Takova称，实际上目前已知功能的lncRNA还不足1%。然而，越来越多的研究显示lncRNA在细胞正常分化和肿瘤发生中都具有重要作用。随着人们渐渐了解到正常和疾病状态下非编码RNA的差异，科学家们认为可以将非编码RNA作为生物指标进行疾病诊断和预测。如何开展lncRNA功能研究呢？专家们介绍，除了表达谱研究以外，与特定lncRNA相关的蛋白编码基因也能够提供lncRNA功能的宝贵信息。Illumina公司RNA和表观遗传学市场经理Chris Streck也认为比起只研究编码RNA，分析整个转录组无疑更有价值。他指出，在ENCODE（DNA元件百科全书）计划的推动下，研究人员现在更注重综合性研究，包括RNA、DNA及调控功能等多个方面，其中非编码RNA的作用日益凸显。（ENCODE项目的目标是在人类基因组中确定所有转录区域、转录因子关联、染色质结构和组蛋白修饰。）生物通 BC Cancer Agency的博后Ewan Gibb（Wan Lam实验室）正在研究lncRNA在疾病中的作用。“尽管不少lncRNA都已经有基因组注释了，但大多数lncRNA的功能仍然缺乏证据，” Gibb说。“我很肯定有成千上万的lncRNA都是功能性的，但我们仍需注意，普遍性转录并不意味着具有普遍性的功能。从转录谱着手深入阐明lncRNA的功能是至关重要的。”例如，罗马Sapienza大学的研究团队就阐述了一个lncRNA的功能，它作为内源性的竞争RNA控制着肌肉分化。Gibb指出，lncRNA研究的另一项挑战是找到lncRNA结构与其功能之间的关联。“有研究指出，lncRNA的结构以域为基础，这有点类似于蛋白质编码基因，”他说，“但这种组织形式如何形成，lncRNA的结构与其功能又有何关联，还有待进一步研究。”在癌症等疾病中的作用有一点很明确，lncRNA在疾病中有重要作用。lncRNA如何对疾病进程产生强烈影响呢？安捷伦公司资深科学家Anne Bergstrom Lucas介绍了Broad研究所的一项新研究，p53通常抑制着数百个基因，若下调p53相关lncRNA的水平，就会影响这些基因的表达。“指出lncRNA具有肿瘤抑制或致癌的直接作用，将为开发癌症新疗法打下基础，”她说。此外，ENCODE项目的最新进展也显示，约有80%的非编码基因组在基因调控中起作用。Gibb正针对在人类癌症中表达异常的lncRNA进行功能研究。“一般来说，我们可以用计算机对深度测序所得数据进行分析，以此确定疾病中表达异常的lncRNA。而要阐明这些lncRNA的功能则依赖于传统的生化方法，”Gibb说。“解析lncRNA在人类癌症中的功能，不仅能大大拓展癌症治疗的靶标，也将有助于人们开发新的癌症治疗方法。例如，可以通过反义RNA或靶标lncRNA-蛋白相互作用来进行基因调控。”已有许多研究显示，lncRNA不仅是调控者，也可以作为疾病的生物指标，例如名为HOTAIR的lncRNA。HOTAIR在原发乳腺肿瘤和转移瘤中的表达都会增加，原发肿瘤中HOTAIR的表达水平可以用来有效预测癌转移和死亡。还有一种称为PCA3（prostate cancer antigen 3）的lncRNA在前列腺癌中高度过表达。这种lncRNA是在尿液中发现的，相当便于临床检测。最近FDA已经批准了一个可以用于临床的商业化检测试剂盒Progensa PCA3 test。此外，据Arraystar的Davis介绍，在肝细胞癌中lncRNA-HEIH也高度表达，可以用Arraystar的LncRNA芯片进行检测。除了癌症以外，lncRNA调控在一些遗传疾病中有重要作用，例如lncRNA调控异常与短指/趾畸形和HELLP综合症有关。而且有研究显示，lncRNA能够稳定阿尔茨海默症关键酶的mRNA。lncRNA能为我们揭示编码基因以外的疾病调控机制么？“在我看来，最令人兴奋的进展是，有越来越多的证据显示lncRNA与主要人类疾病密切相关，而且lncRNA与蛋白编码RNA相比，能够更好的用于疾病诊断和预后，”Arraystar的Davis说。希望有朝一日，非编码RNA能够成为帮助人们抵御疾病的有力武器。
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。 2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点 因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。 6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。 6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。
2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。
在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。
2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。
CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所
“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”
除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”
此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。
Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”
该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。
3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。
同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。
近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。
此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。
图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）
A.质粒示意图；细胞中 Pten 的下调；检测PTEN及AKT的表达； 与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达
图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）
A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。
图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）
A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；蛋白的表达；病毒质粒示意图；F.实验流程图；的mRNA表达水平；.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；面积统计。
2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。
该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。
人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。
在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。
作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。
帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。
该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。
大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。
研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。
为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。
在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。
需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。
（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。
（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。
（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。
RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.
Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.
Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.
Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.
The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).
Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.
One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.
Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.
Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.
The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.
References
Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272
Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514
\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors
\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA
\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future
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题目：从传统走向现代民族激情中华魂让传统节日文化“长入”今日生活态度：“非遗”保护关键在于提高文化自觉现在申报的非物质文化遗产项目大多数都要求是“活态”的，既需要有人承继，也要具有相当的技艺水平。至于那些已经完全消失的，将不进行申报。另外，非物质文化遗产也提倡一种“尊故融新”的观点，比如像戏曲、相声等都可以表现新时代的内容，但在形式上却不可随便乱改，否则如果一些传统戏曲用小提琴来伴奏，将完全失去了保护的意义。事实上，国外在保持非物质文化遗产原貌方面，有很多经验可以借鉴。比如在韩国，每年都要对非物质文化遗产项目进行检测，检验传承人的技艺是否达到最高水准，如果达不到，就会把这个传承人的名誉名号重新剥夺，直接授给别人，或直接取消这个项目。1“端午节”已进入国家级非物质文化遗产名录“端午文化”作为一种民间民俗化文化形式，具有传承性、全民性、多样性、发展性。它的传承性，表现在于具有顽强生命力，两千年来深深扎根这块土壤，而且向外流传。它的全民性，表现在于具有很强的参与性，正如一个专家说的：“它并不规定，什么人可以过这个节日，什么人就不可以过这个节日，谁都能够参与。”龙舟竞渡“这种赛事活动其实是民间健身运动的雏形。”它的多样性，表现在于文化元素的丰富性，“简直就是一座文化宝库”，既是“怀人”，也是娱己；既有体育竞赛，也有卫生防疫；既要忙忙碌碌，也能休闲享受，等等。它的发展性，表现在于既可采用时尚的元素演绎传统文化，又可在传统形式中装上新的现代内容。充分挖掘端午这一传统节日的文化内涵，就要破除这一节日目前处境的尴尬，不再让“吃”成为过节的惟一永恒主题，不再陷入“文化搭台、经济唱戏”的怪圈。与时俱进，推陈出新，挖掘其中没被发现的元素，增强其文化娱乐性。如龙舟竞渡可衍化为全民健身活动。龙舟竞渡本身含有体育竞技、全民健身的元素。应该看到，龙舟竞渡是所有的端午文化元素中最先、最彻底“现代化”的元素。它让群众既享受龙舟竞渡中“更快、更强、更美”的快乐，也让群众在运动中体味竞争增强体质、锻炼意志、强健体魂的意义，还让群众体味到了竞渡运动中团结、争先、向上精神内涵。插艾挂菖等可衍化为全民爱国卫生活动。插艾挂菖，还有挂香囊、饮雄黄酒等，本来是为“避魔驱邪”、“消灾杀虫”，也就是古代的卫生防疫活动，如果在这种习俗中输入现代防疫手段，无疑具有爱国卫生运动意义。走娘家、看老戏等可衍化为休闲。“牛歇谷雨马歇社，人不歇端午被人骂”，在端午节休息是自古以来的“规矩”，因此，将自古以来的“歇”引导成农民的现代休闲，是提高农民生活质量的一个重要途径。给你一个网址有“非物质文化遗产”的介绍参考资料：.cn/
中华民族不仅有灿烂的文化，更有令人瞩目的遗产。遗产，《辞海》上解释为历史上遗留下来的精神财富和物质财富。而冠以文化二字，则说明与文化相关。而前面又修饰以民族、民间四字，更加明确其意思是指散落在民间，流传在民间，而又被人民大众喜闻乐见的民间文艺、民间舞蹈、民间文学、民间音乐、民间节日、民族服饰、少数民族英雄史诗、话本等物质的和非物质的文化形态（状态）。文化遗产是一个民族的特质。既向世界宣告其曾经的辉煌，也向世界证明其精神之本。中华民族的非物质文化遗产是众多的，有许许多多已经进入了世界文化遗产的行列，诸如莫高窟、都江堰、黄山等等，随着辽宁一宫两陵、牛河梁文化遗址、五女山古城等一批文化古迹相继申报世界文化遗产工作的进一步展开，在辽宁乃至全国兴起了一股保护、传承非物质文化遗产的热潮。非物质文化遗产的保护大致可分为三个阶段：①学者保护。②政府保护。③世界保护。
当玛雅文明隐没于未知的空间,当古巴比伦王朝终结于漫漫硝烟,当古罗马斗兽场成为永久的遥想,当古埃及金字塔化身为玄妙的谜团……惟有你,依旧昂首挺胸,屹立于世界东方.挺过战火,挺过饥荒,你步伐坚定,意志坚韧,你教我怎能不为你倾心——伟大的中华,伟大的传统,伟大的文化!但如今,对于你,我在喝彩之时更多了份感伤——熬过了无数的苦难,为何你要在繁縻的花开间独自黯然的凋零呢?为何你要在这和平的年代里缓慢而沉重的迈向终点呢?是为了不成为科技发展的绊脚石,让十三亿中华儿女过上更富裕的日子吗?抑或是,我们这些做儿女的为了追求那份物质的满足而无情的牺牲了你,让你不得不与我们含泪诀别?不难发现,国画正与我们的生活渐行渐远,毛笔早被鼠标排挤到书架的角落,茶道在中原土地上逐渐失落：它们却在异域文化里日渐兴起,蓬勃发展.原来是我们的淡忘让你“日薄西山,气息奄奄”!不难了解,一排满载美食的摇船,满足了游人们的舌头,却破坏了满载诗情画意的西湖水澄澈的美丽；如日中天的旅游热,将旅行社的口袋染成了金色,却给丽江古城的宁谧漆上了无法退却的乌黑……原来是我们的过度开发让你“人命危浅,朝不虑夕”!外来的敌人再强大也不曾将你击倒,你悉心呵护的儿女却轻易的将你伤得体无完肤；你赐予了我们文明后裔的光环,我们却在无知迷茫的脚步里将之粉碎.伟大的传统文化,请等等怀着无尽歉意的十三亿中华儿女吧!时间换得了科技的发展却唤不回消逝的文明,金钱弥补得了物质的匮乏却丰富不了虚空的精神.你已给我们造就了无可比拟的财富,所以,我们难道不应该放慢追逐科技的脚步,去捡起心灵深处关于你的记忆；我们难道不应该淡却金钱至上的观点,去治愈你那血淋淋的创伤么?现在,我们怀着让你在未来的五千年、五万年乃至五亿年的时间里依然君临天下的决心去弥补我们的过错,这样,你会停止呻吟,重舒眉头,展露笑颜,永远相随在我们的左右吗?所以,请等等我们吧,不要就这样离我们而去.把根扎下,心灵之花会璨然绽放；把根扎下,民族之树会枝繁叶茂.所谓非物质文化遗产,根据联合国教科文组织2003年10月17日通过的《保护非物质文化遗产公约》中的定义,即指各种以非物质形态存在的与群众生活密切相关、世代相承的传统文化表现形式,包括口头传统
非物质型的文化遗产属于中华民族历史发展的重要结晶，属于人类生活紧密联系的一种文化的具体表现形式，包括：民间传统知识、手工技艺等，发展至今已有上千年历史。
最近几年，随着我国社会经济快速发展以及科学技术的不断进步，非物质型文化遗产让高科技型的产物逐渐替代，反映出历史发展当中，人类慢慢淡忘了非物质文化遗产，对原生态化文化遗产整体保护与传承造成了一定阻碍。
为发扬中华民族的重要智慧结晶，我国对非物质型文化遗产的重点保护愈发重视，相继颁布各种规范与条约，进而明确提到非物质型文化遗产的有效保护以及传承工作的关键。所以，本文主要阐述非物质型文化遗产基本概念，探讨保护与传承的价值，以期提供相应参考与借鉴，给非物质型文化遗产良性发展提供助力。
非物质文化遗产滋养了纳西族多元的传统文化
纳西族的非物质文化遗产具在深远的文化意义。它不仅是纳西方文明的起点，在漫长的历史岁月中，它又不断地与各种文化交流而逐渐丰满。纳西族丰富多彩的非物质文化是其文化多样性的生动体现。它像永不干涸的河床承载着纳西文明，使之得以薪火相传。
“它犹如民族文化的基因库，人文学科、自然学科都源于其中，文学艺术更是以非物质文化作为其生长的肥沃土壤。像诗歌艺术根植民歌民谣，小说创作的母胎是民间故事的口头传承一样。”
而今无论是大型实景演出《映像雪山》、民族歌舞汇演《丽水金沙》还是闻名遐迩的纳西古乐、东巴歌舞，其原初形态都是当地民族民间的音乐与舞蹈。
非典型性肺炎 （Atypical pneumonias）是指由支原体、衣原体、军团菌、立克次体、腺病毒以及其他一些不明微生物引起的肺炎。而典型肺炎是指由肺炎链球菌等常见细菌引起的大叶性肺炎或支气管肺炎。 其实在医学界，人们对03年发生的这场传染病的名称存在争议，因为已经查明，这种病其实并不是医学上通常所说的“非典型肺炎”，而是“传染性冠状病毒肺炎”。 对于这种型传染病，人们的认识有一个逐步深入的过程，概念也渐趋正确。起初人们认为，致病原因是衣原体病毒，直到03年3月份才弄清其病原体是“冠状病毒”。我国广东医生在与病魔的搏斗中，根据其临床上有发烧、咳嗽、肺部有阴影等肺炎共性症状，但与由肺炎链球菌等细菌引起的肺炎相比，症状不够典型，病原体尚未完全明确，而且有传染性强、使用抗菌药物治疗无效等特征，于1月22日首次使用“非典型肺炎”来命名它，世界卫生组织也确认了其医学名称Atypical pneumonia，简称ATP。2月底，世界卫生组织的意大利籍传染病专家卡洛·厄巴尼（Carlo Urbani）大夫根据当时已经掌握的情况将其命名为severe acute respiratory syndrome (简称SARS)，3月15日世界卫生组织正式以此取代了ATP。 事实上， severe acute respiratory syndrome这一命名也没有充分反映该病症的本质特征，早有人建议应该将其命名为“传染性冠状病毒肺炎”（果真如此，可缩略为“冠肺”）。这种建议虽然尚未被社会和医学界接受，但足以佐证了SARS和非典一样，都是反映人们一定阶段对事物区别性特征的认识。 目前已经找到治疗方法，中国和欧盟科学家联手，成功找到了15种能有效杀灭非典病毒的化合物，为合成非典治疗药物提供了新方法。中欧科学家2005/6/9日在杭州结束的“中国—欧盟非典诊断及病毒研究”项目学术年会上公布了这一成果。 香港大学的新近研究表明，蝙蝠可能是SARS病毒野生宿主 计算机汉字输入专家周钢曾于2003年建议“非典型性肺炎”可以称为“肺痶”。 不过，仍然建议应该按世界卫生组织（WHO）的命名原则，在医学界称之为SARS（音“萨斯”）。香港医学界在第一时间与WHO一样，改称为SARS，中国大陆地区，因为民间一直以简称“非典”来称之，故在词条本身，不建议更改。
病毒可以算作某种疾病。
[作文课堂]2009最热素材：甲型H1N1流感 背景概况2009年3月，墨西哥和美国等先后发生甲型H1N1流感，其病毒为A型流感病毒，H1N1亚型猪流感病毒毒株，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片断，是一种新型猪流感病毒，可以人传染人。观点罗列1、人类不能善待动物，恶劣的饲养环境为病毒的生长和变异提供了机会。
人类不爱护环境和滥用抗生素 。2、人类对自然的掠夺破坏越来越厉害。
研究证明，66%的传染病病是从动物身上传播而来。3、病毒加快变异论：病毒变异性的加快与“物种障碍”的跨越加快，使人类面临的危险越来越大。
4、病毒比人类更具有智慧论：病毒不断寻找人类的弱点，加以利用。人类与病毒的持续战斗，病毒战斗力越来越强大。
5、全球公共卫生预防机制应该趋于更加完善，科学预防需要全球合作，科技发展需要大力尊重自然。6、气候变化论：气候变化促进动物传染病的发生与传播。
全球气候变化肯定会促生部分细菌发生变化，这样，人类的危险不单单就是宏观上的，微观世界也在酝酿着病变。集中讨论点关键词 人与自然 自然环境 环境保护 人类危机 全球问题 公共卫生 反省意识 生物病毒 生态掠夺 人为阴谋 生命代价 和谐契合 【焦点解读】 人类正在改变着地球，而这些改变的背后却引发了良性质变和危险隐患。
随着时间的迁移，有了许多新的疾病和名词， “非典”、“禽流感” 、“甲型H1N1”流感这些看似陌生却又如此熟悉的病菌像一阵飓风骤然降临，而这一切正在改变着我们。这一社会焦点是值得我们的重点关注。
它关涉着“人与自然” 、“全球问题”、“公共卫生”、“生态保护” 、“环境”、“危机”、“反省”、“灾难”、“珍惜”、“尊重”、“震撼”、“生命”、“合作”、“和谐”等话题，而这写话题也是我们高考所关注的。[运用实例] 话题1 人与自然 自然，是动植物的栖息地，是生命的起源，是我们的一切的源泉。
人类诞生于天地之间，生存于大自然之中。集灵气与采万精华的我们勇敢地从洪荒时代走到了文明的世纪。
人与自然存在着莫大的关系。在自然中，人类的智慧创造了经济的奇迹，而无知与贪婪却留下了可怕的后果。
现在的地球已经发出了痛苦的 *** ：环境污染，生态恶化，病毒横行。这一切是值得我们的深思。
03年的非典、04年禽流感、今天的甲型流感无不让我们深思人类应如何对待大自然？人类该怎样与自然和谐共处呢？也许是一个简单的答案：善待自然和谐相处。善待万物，就象善待我们的朋友；拯救地球，就是拯救我们的家园！人与自然相通相依，协调一致，和谐共处，是人与自然和谐共处的主要思想。
话题2 灾难 面对“甲型H1N1流感”的到来，也许我们想到一个灰色的词“灾难”。其实我们已经经受了无数的灾难了。
厄尔尼诺、温室效应、全球气候变暖、海啸、非典、还有现在的甲型流感，这里的每一场灾难无不伤痛着人类的脆弱的神经。而这一切究竟缘何。
也许是自然对人类的惩罚，也许是地球对人类的惩罚，到底是什么，为什么会有这么多的灾难，我们在思索着。人类进入工业时代后，掠夺性地开采，工业污染严重，全球温室效应明显，人类的进步是建立在掠夺自然的基础之上；任意残杀其他物种，北冰洋的海豹被剥皮，海洋里的蓝鲸被宰杀，山林里的稀有物种被烹饪等等，人类的食欲是建立在残杀生灵的基础之上。
简单地总结，境破坏，生态失衡，灾难就频发。低下头吧，高傲的人类将目光放的长远些吧；咽下涎吧贪吃的人类将口味放的平常些吧，不然，人类只能自己承担地球的惩罚——频发的灾难。
话题3 反省 反省是人类不断进步的思源。而缺乏自我反省是人类的共同弱点，不仅限于对大自然的傲慢，更主要的是总有理由为自己的过失开脱责任。
气候异常，三废严重，恶疾流行，灾害频仍，因工业和现代社会生活方式诱发的环境恶化问题，已成为当前世界性的热门话题和共同难题。当人们纷纷行动起来，就事论事地解决各种具体的环保问题的时候， 人类需要真正反省自己了。
因为对大自然的傲慢，环境污染破坏已促成了更多的菌体变异。人类的自我中心主义，漠视自然的盲动行为，已经成为了悬在人类头上的达摩克利斯之剑，还有多少病毒将要变异？人类还要尝试多少自食其果？这一切在告诉我们，必须静下思维来，认认真真地反省了，反省人与自然的关系，反省自然环境的问题，反省工业与自然的关系，反省人类自身的弱点等等。
从根本的内容，根本的原因，根本的关系上，我们去反省，也是对人类哲学及我们的人性本质思考。话题4 生命 生命是宝贵的，地球上的无数形式的生命都是宝贵的。
地球上的生命又都有着各种千丝万缕的联系，生命的彼此关联又都造就了世界的多彩。丰富多彩的地球世界，又时时刻刻充满了各种因素的威胁与危机，而这些威胁与危机动辄就是生命的毁灭。
历史上的“西班牙流感”夺走40000—50000人的生命；“亚洲流感”使全球至少100万人死于这场灾难；“香港流感” 至少波及世界55个国家和地区，造成全球150万-200万人死亡。现代医学的进步依然挽救不了03年的非典的900。
SARS病毒的自述
真没有想到啊，我来世上居然变成了一颗冠状病毒，你们知道什么叫冠状病毒吗？这可是非典型肺炎的制造者啊，怎么样，我很了不起吧。
也许有许多人恨我和我的同类吧，然而，你们想过没有，是谁，造就我们呀，是你们呀——作为人类的你们呀！你们无情的杀害了小动物——果子狸，当它们成为你们的盘中餐时，你们也迎来了恶运。
下面我给你介绍一下我的日常生活吧。
我寄生于一只果子狸身上，当它成为你们盘中餐时，我也成功地进入我的第一个“猎物”体内，我顺着他的血液在体内循环了一圈，让他染上SARS。
在他还没有发病前，我又迅速逃到了他的牙齿上。他还不知道，当他去银行存钱时，我连忙从他的口腔中跳出来，落在一张百元大钞上，通过钱，我又顺利地到达一个银行工作人员的体内，我走过她的喉咙，跳过她的胃，跑过她的肝，又通过了她的肺，我又成功地使一个人染上了“非典型肺炎”。
这个银行工作人员在与别人会谈时，握了下手，我又通过手指到达了另一个人的身上。—————
但是，我使这个人染上了“非典”，又到了别人手上时，那个人正好洗手，我祈祷着别用肥皂，可他却用了，那刺鼻的气味差点没把我熏死。
我生命就要结束了，我一生共十几百人染上了“SARS”但我最终还是被洗手液要了命，朋友们，记住：“要不想我侵袭你，就要讲究卫生，勤洗手，常通风哦！”
早在古时，诚信就已受到了重视。着名教育家孔子认为，在社会生活中，“信”是一个人的立身之本，如果不守信，也就失去了做人的基本条件。就连伟大的奸雄曹操也深知守信之重要：要夺取天下，赢得天下人之心，不守信焉能服众？
其实，做到诚信并不难，关于它，我们身边就有不少——记得有一次，我和妈妈上街去玩，突然听见“啪”的一声，原来是车胎爆了。我们只好到附近的车行去修，修车的是一个老头，他笑眯眯地接过自行车，动作熟练，仔细地检查后，告诉我们车胎被硬物刺破了，并给我们内外胎都换上了新的，而且只收了25元，我想他肯定是一个善良热心的人。这场风波结束以后，我们觉得很口渴，就到较远的商店去买饮料，付钱使才发现妈妈钱包不见了，一定是落在修车那里了。这就麻烦了，如果别人拿了不认帐我们也没办法，包里可有好几百块钱了呀！正当我们急匆匆往回赶时，迎面却碰上了那个老头，手里捏着妈妈的包，气喘吁吁地赶过来：“你们的钱……钱包忘拿了，不……不然就麻烦了！”我们高兴得不得了，十分感激，真是一个诚信善良的好人呀！
你知道这个故事吗？早年在尼泊尔的喜马拉雅山南麓很少有外国人涉足。后来，许多日本人到这里观光旅游，据说这是源于一位少年的诚信。一天，几位日本摄影师请当地一位少年代买啤酒，这位少年为之跑了3个多小时。第二天，那个少年又自告奋勇地再替他们买啤酒。这次摄影师们给了他很多钱，但直到第三天下午那个少年还没回来。于是，摄影师们议论纷纷，都认为那个少年把钱走了。第三天夜里，那个少年却敲开了摄影师的门。原来，他只购得4瓶啤酒，尔后，他又翻了一座山，趟过一条河才购得另外6瓶，返回时摔坏了3瓶。他哭着拿着碎玻璃片，向摄影师交回零钱，在场的人无不动容。这个故事使许多外国人深受感动。后来，到这儿的游客就越来越多……
有人说，诚信是金。而我认为金子有价，诚信无价，诚信更胜于金。失去了做人最基本的诚信，纵然有万贯家财，又有什么意义可言？诚信是无形的财富，是人间最美好的财富！
如果出现类似于感冒发烧的症状该怎么办？？甲型h1n1流感症状是什么？
1。首先，发烧应注意不能盲目的吃退烧药，确需使用退烧药时也应严格按体重，控制在安全剂量正确服用，退烧药吃多了对身体不利，应查清病灶所在，对症下药，从根本上根治病灶。
2。甲型H1N1流感的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等症状或其中部分症状，如果不及时治疗，病情延续会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。
3。注意：猪流感早期高烧体温并非全部都是马上高于39°，也有渐渐升高或反复发作的。
4。虽然秋季到来，季节交替的时候很多人都容易感冒，发烧等身体不适，但甲型H1N1流感的早期症状恰恰与普通人感冒相似，很难鉴别。由于现在是甲型H1N1猪流感流行时期，如果其症状与甲型H1N1流感症状中的部分早期症状相似，为了安全起见，就应该极早到医院发热门诊或感染性疾病科去检查一下，做一个甲型H1N1流感病毒检测。
5。注意：现在是甲型H1N1猪流感流行时期，去医院这种高传染源的地方一定要戴上口罩，口罩要选标准的防尘口罩，薄的普通口罩只能保证病不传染给别人，却无法保证去医院途中及就诊时被别人传染H1N1 。马虎不得！！！！！！
6。我建议如果有与甲型H1N1流感相似的症状出现，感觉身体不适，就应该马上到公立医院去检查一下.免得耽误病情！大医院有保障些，迟了会影响您的健康。
希望我的回答对您有所帮助。
怎么预防甲型H1N1流感？？？
国内目前还没有甲型H1N1流感预防药物研发生产出来，切勿轻信网络上非官方的H1N1流感药物宣传。
最好的预防“防范”措施就是接种疫苗，我建议您还是极早去接种h1n1流感疫苗。
1。各地的“疾病控制中心”（卫生防疫站）和医疗行政机关指定的公立医院都可以接种甲型H1N1流感疫苗！
2。接种疫苗的具体细节可以向当地的“疾病控制中心”（卫生防疫站）和医疗行政机关咨询。
3。“疾病控制中心”（卫生防疫站）和医疗行政机关的咨询电话可以向“114查号”台查询。
4。注意：现在是甲型H1N1猪流感流行时期，去医院这种高传染源的地方一定要戴上口罩，口罩要选标准的防尘口罩，薄的普通口罩只能保证病不传染给别人，却无法保证去医院途中及就接种h1n1流感疫苗时被别人传染H1N1 。马虎不得！！！！！！
希望我的回答对您有所帮助。
您的周围有人出现流感症状就应该注意：
1。勤开窗通风，保持室内空气清新，去药店购买消毒液（现在各地的医药商店都备有大量的用于预防甲型H1N1流感病毒的消毒液）对室内进行全面的消毒，尤其是房门的把手、衣柜门、茶几、沙发扶手等更应该严格消毒；餐具茶餐也应严格消毒并专人专用，提倡分餐制。
2。保持良好的生活习惯，做好个人卫生，勤晒衣服被褥，要勤洗手，生活用品勤洗刷，勤消毒。
3。当您接触过家庭其他（她）成员的公共物品后一定要先洗手，再去做其它事情，切忌在不洗手的情况下触摸自己的眼睛、鼻子和嘴巴等容易感染的部位。
4。多喝板蓝根等清热解毒系列冲剂茶能起到预防保健作用。
5。保持健康良好的心态，积极参加体育锻炼，增加抵抗力，提高自身的免疫功能。
希望我的回答对您有所帮助。
爱滋--------一个不容忽视的字眼~
忘记了是从那一天起，爱滋病这个略带西方色彩的字眼闯如了我们的生活.它惊醒了沉睡中的我们.让我们认识了爱滋，了解了爱滋，惧怕了爱滋，远离了爱滋病人.
人性就在这时体现了.普存忻这个我不太熟知，但是他是有名的爱滋病大使.也许我连他的名字都不会写，可是我从心里崇拜他，因为他有一颗剔透的心， 高尚的灵魂.其实我心里也知道，爱滋病是靠性传播，血液传播，母婴传播的.可是就是人性的自私，我也保护我自己，如果有一个人他站在我面前说要和我握手， 而且告诉我他是爱滋病人，恐怕我也会胆怯，我也会踌躇.可是他呢！毅然的和他们握手，吃饭，交流.也许这些在正常人与正常人之间太微不足道了.可是如果是一个正常人和一个爱滋病人之间，那么是多么的崇高的一种气节.是多么的伟大.他们做到了，可是今天的我真的做不到.
人之初，性本善.也许是自私抹杀了我的善良.也许是自己保护的意识让我收起了善良.今天我只能在这里高唱凯歌，百般称赞那些能做到和爱滋病人平等的人，
现在，有一种蔓延全球的流感来到了中国，它就是甲型H1N1流感，简称甲流。这种病的症状跟普通的感冒症状一模一样，都具有发烧、咳嗽、嗓子痛等症状。
甲流是一种很可怕的传染病，因为这种传染病的传播速度相当快。妈妈从网上给我找到2009年甲流高发期时的新闻：据卫生部14日通报，9月11日15时至9月14日15时，我国内地新增甲型H1N1流感确诊病例1598例。世界卫生组织在11日说，目前甲型H1N1流感已造成全球至少3205人死亡。多么吓人的数据啊。
面对这么可怕的甲流，我们应该怎么做呢？首先，我们不必太担心，别没得上病，自己倒吓出病来了；其次，我们平时要注意做好防护工作。做到如下几点：不要去人多的地方；要经常用流水洗手，并使用具有杀菌效果的香皂，把手上的细菌洗掉、杀掉；要保证充足的睡眠，保持乐观的心情；我们要多多锻炼身体，增强抵抗力，让病毒远离我们。
妈妈说：甲流的传播途径是飞沫，但是可不要小瞧飞沫，飞沫可是带着病毒的哦！发烧，是得病的重要原因，为什么会发烧？发烧是由内热和外热引起的。那么，怎么避免发烧？外热，是指，运动流汗这一类；内热是指，吃高热量的食物。而流汗是生活中不可缺少；既然不可缺少的，我们就来减少内热，在非常时期，最好不吃高热量食品。
甲流确实很可怕，但只要我们大家团结一心，共同抗击，又有伟大的祖国作为强大的后盾，甲流是逞强不了几天的！
我的印象中他是一只夕阳下的蝴蝶，也是一名艾滋病患者。他是一个曾经充满活力的人，同时也是一个与AIDS抗争到底的勇士，我写下这些文字的时候，脑海中突然出现一个从来就不会倒下的身影，一个随时随地出现在BBS和HIV群鼓励着病友的身影，一个曾经承受着各种陌生眼光和评价的人，一个冒着大雨跑向 *** 机关为艾滋病群体争取一点抗艾中药的人，冷夜时分如果你打开电脑会看到一个，开导和教育恐艾者的人，他是一个不知疲倦的人，不断讲述着自已的记忆，如何去珍爱生命。他会教你医学常识，同时他也非常敏感，能看到你眼中是否对他充满歧视。平时他总在收集新闻和寻找抗菌良药，于黑暗参差闪烁电脑前书写悔恨，并寂寞的从键盘上拭去泪水。如同我此刻的感叹，当生命中堆积太多酸楚和悲伤的时候，我们发现天堂和地狱实际是同一个方向，生的意义就是产生意义，于是他清醒的知道每一天的生活方向，怎样使其更有意义。他并不像我们每天早晨起来能看到母亲的关怀，有丰富的早餐，床边有撒娇的小狗，每天晚上手握MP3，或者手执一本漫画言情，他没有那样休闲。据我所知他有太多的时间以空洞的姿态睡在医院氧气瓶旁边，输入冰冷的针液，同时喝下那些流质般米汤吐出来的却是中药，从不小心掉落的药瓶旁捡起那些五彩缤纷的抗病毒颗粒，为了完成所谓的治疗生存在低烧和腹泻的世界，但是，他和与他有着相同经历的人更比我们懂得如何超越生命的极限，他比我们更知道怎样去爱，与及为爱他的人而活着，他会强装药物有效，用微笑来安慰自已的母亲，他深知已经走到晚期，却在无数次创造生命的奇迹，然后奇迹般的出现在医学论坛，携带者空间，HIV的QQ群，无数次对陌生人提供知识和精神的抚慰。他会想方设法欺新来的HIV携带者，当他们绝望时给予他们希望。他会把那些永远无法消除艾滋歧视的事件拿来夜里感叹，并开始记录所有的，三甲医院的人员，是怎样拒绝了他，把他从夜里赶出去，然后所有的针头都在躲着他，所有的手术刀最好不要切割他的血管，所有的床单！所有的药瓶！所有和HIV有关的都要砸掉，烧毁！不要大声的说出这是艾滋病！一个中国人最鄙视的病种之一，最好把所有的声音关小一点！然后他在寂寞的时候会哭泣，哭泣的时候嘲笑命运，寂默的时候，还在帮助那些有着跟他同样经历的人，他说他经常看到梦里的蝴蝶从乱草残墓中飞过，飞过大山，飞到繁华的城市，飞到那些在危险中爱恋的人群，擦过那些站街女的裙角，越过男同志的床前，停在毒品使用者的肩上，然后在黎明时分飞向希望，飞向我们不知道的世界。也许在那儿，不会有伤悲，不会有感叹，不会有思想，不会有曾经和将来，也不必绝望和希望。不管怎样，我知道，现在他要动手术了，可惜我没有太多的钱捐给他，何况他最终要走一步的，几年下来AIDS轻而易举毁了他的家，他的爱情，人生，也夺光了这个家庭的所有积蓄，然后慢慢让亲戚也为他背起债来，没有人希望走到这一步，由于治病负债太多，家里的人最后只有流泪的能力了。捐款不能让他活下来，只是能让他多活一天，一天有多少意义呢？但总是一天。我没有能力让很多人为他捐款，在他目前感染到巨细胞病毒眼睛在糜烂的时候，我帮不了他，他失明不需要多长时间了，在他走向尽头的时候，我希望他多看一天阳光，多吸入一口空气，多撑一天，然后有力气在雨后推开窗子，在微风里享受生命的美好，他和我们一样喜欢蓝蓝的天空，碧绿的草地，喜欢阳光下踢球的小孩。如果能永远这样，是多么奢侈的事啊。我们生在世上得到的荣誉和平时思考的人生意义，不完全是拼命的赚钱，拥有财富和享乐，还有适度对需要的人进行奉献。但这样的奉献还是无法让他活下去，只是他会记得帮助过他的人，并且将来在飞向夕阳的那一天，真正的成为一只蝴蝶，从容而没有痛感的，向我们挥起翅膀。他总会说你们要好好的生活，珍惜生命，拒绝419，毒品，卖血，高危。生命真的是太美丽了，他说。
是的，我写到这里，阳光绽放在我的窗前，窗纱飘扬在我的床边，这是一个美丽的早晨，是的，一如他所愿。
责任 每年每月每日，成千上万件事向人们扑来。在忙碌的生活中，人们手忙脚乱，疲惫不堪。虽然如此艰辛，却始终持之以恒。因为有一个沉重的锁链无情的套在我们的身上--责任。 在学校里，我们努力学习，这是责任。在家里，我们帮父母做点家务活，这是责任。出门在外，为社会做点事，这是责任。大千世界，草有责任，花有责任，大树有责任。无论什么生命，都有自己不可推却的责任。 对自己付责，也要对别人付责。在全国每年都有上千起交通事故，发生的原因种种，可说来说去，这不是没有责任心吗？如果汽车司机有着对自己对别人付责的心态，按规张制度办事，那还会有这么多人白白丧生吗？ 责任，是重如泰山的承诺。它推动着一代又一代的人勤勤恳恳的在各自的岗位上奉献着。在今年全国遭受“非典”的袭击下，600万医护人员勇敢的冲向了第一线。他们英勇，他们无畏。在同“非典”的战斗中，谁也没害怕，谁也没退缩。任凭“非典”有多么可怕，却无法吞咽医护人员那颗强烈的责任心。病人来了，每个人不分昼夜，细心照顾；有的医护人员倒下了，就立刻有人补充上来。在这场没有硝烟却比枪林弹雨更危险的战斗中他们没有辜负国家和人民寄予他们的厚望。最终，“非典”被制了，这是用医护人员没日没夜的奉献和那颗强烈的责任心换来的。如果他们没有一颗强烈的责任心，那就不知道这场风暴还要刮多久，还要夺去多少人无辜的生命。 古希腊人说，人是背着一个包袱走路的。包袱里有家庭， 事业，友情，儿女……历经艰辛，却无法丢弃其中任何一件。因为这上面写着两个字：责任。在生活中，处处都有责任的考验。不经意的捡起一张废纸是保护环境的责任；帮助体弱多病的老人和小孩，是尊老爱幼的责任；替别人解决困难，是助人为乐的责任。责任，是社会的地基。没有它，高楼大厦在微风中就会轻易动摇。对自己付责，责任是严格的教官；对别人付责，责任是生命财产安全的保证；对国家付责，那是社会进步的条件。抛弃它，感到了站暂时的轻松，却丢失了一生的光彩。责任，是不可丢弃的使命，它肩付在人们的身上。自由自由！这两个字多么吸引人啊！老一辈的常常把这一些话挂在嘴边：“你们这些孩子太幸福了，我们那年头，只求个三餐温饱，哪像你们现在，什么都讲名牌。”这些话固然有道理，但是经过历史与岁月无情的洗礼，现在的我们犹如一只只被关在笼中的小鸟，眼巴巴地望着外面的世界，整天接踵而来的考试使我们失去了享受童年的机会。就如一首歌中唱的一样：“我是一只小小小小鸟，想要飞却飞都飞不高……” “我要飞得更高” 面临社会不断地改革进步，社会上的人才也就越来越多了。家长们为了让自己的孩子适应社会，便不断要求自己的孩子。“望子成龙”的观念也是为了孩子着想。但是如果过于严格只会：“望子成龙，子成虫。”我曾看过一份调查，上面写出了以前孩子一天的活动与如今孩子一天的活动。对比之下，现在孩子的压力比以前孩子的压力大了4倍；相反，现在的孩子一天的娱乐比以前的孩子少了25％面对着无情的数据，让我怎能不渴望那令人向往的自由呢？“我要飞得更高！飞得更高……” 自由！自由意味着解脱了束缚；自由意味着飞翔于天空。自由！我渴望自由。
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。 2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 研究背景 胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。 研究方法 研究结果 1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志 作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。 2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要 作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。 3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达 作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。 4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用 为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。 5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点 因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。 6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长 为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。 研究结论 通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。 2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 研究背景 结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。 研究方法 研究结果 1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关 为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。 2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢 为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。 3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活 METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。 4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点 为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。 6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因 作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。 研究结论 METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。 参考文献 [1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020. [2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
环状RNA(circular RNAs, circRNAs)是一类由mRNA 前体(pre-mRNA)经反向剪接形成的共价闭合环状非编码RNA。CircRNA最早是在上世纪70年代在病毒中被发现，但是由于早期RNA文库制备广泛使用polyA富集的方式（circRNA没有游离的5’和3’末端），以及RNA-seq读数要求以线性方式与基因组对齐的计算算法，导致大量circRNA的信息被遗漏，使得人们一度认为环状 RNA 只是错误剪接的副产物，对circRNA的关注并不高。 随着高通量测序技术和生物信息学的发展，成千上万种circRNA被发现，围绕着circRNA的基础研究也越来越多。大量研究表明circRNA在哺乳动物细胞中具有内生、丰富、保守、稳定等特点，并经常表现出组织或时空特异性，可以通过多种机制参与机体生长发育调控，以及疾病的发生和发展。因此，近年来circRNA逐渐成为非编码RNA研究领域的热点。 根据circRNA序列的来源，可以分为3类： 1. 序列全部来源于外显子，称为Exonic circRNAs 2. 序列来源于外显子和内含子，称为EIciRNAs 3. 序列全部来源于内含子，称为ciRNAs。 circRNA是由mRNA前体（pre-mRNA）经反向剪接（back-splicing）形成的，目前报道的成环模型主要有以下3种： · 内含子反向互补序列驱动环化环化 外显子两端的侧翼内含子含有多对反向互补序列，反向互补序列促使内含子序列配对，使得下游的剪接供体（Splice-Donor）与上游的剪接受体（Splice-Acceptor）靠近，从而结合形成环状RNA。（图1.左） · RNA结合蛋白驱动环化 环化外显子两端的侧翼内含子含有RNA结合蛋白（RBPs）识别的基序，RBP分别与两翼内含子特异基序结合后，会形成二聚体，促进两翼内含子互相靠近，进而连接成环。（图1.右） · 套索驱动环化 mRNA前体剪接时，会发生外显子跳读事件，产生包含外显子和内含子的套索中间体，随后该中间体发生反向剪接，形成环状RNA。（图2.） circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，从而影响miRNA对基因的调控。比如研究得比较多的小脑退行性相关蛋白基因(CDR1)反义链转录的环状RNA分子： Cdr1as，它包含约70个miR-7 的结合位点和1个miR-671结合位点，其中与miR-7的结合方式是非完全互补，只是结合，不会被AGO2蛋白介导降解，而与miR-671的结合方式是完美的互补。当Cdr1as高表达时，miR-7被结合，无法抑制原癌基因的mRNA，从而上调原癌基因的表达，导致癌症的发生。当miR-671高表达时，Cdr1as被降解，miRNA得到释放，与原癌基因mRNA结合，起到基因下调的作用，抑制癌症的发生。（图3.） 很多环状RNA上含有蛋白结合的位点，可以作为蛋白的海绵体。如RNA剪切因子MBL，可结合亲本基因第二外显子，促使其环化形成circ-Mbl，circ-Mbl又能与MBL结合，降低MBL有效浓度，减少MBL生成。 除了作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可以作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定的情况下还可以翻译出多肽。根据参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞基质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。 （参考文献：Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.） 随着越来越多内源性的circRNA被发现在人体组织中有着广泛表达，circRNA与疾病的关系逐渐成为焦点。目前研究最多的是circRNA与实体瘤之间的关系，促进肿瘤生成的一些circRNA，如头颈部鳞状细胞癌中的circPvt1；结直肠癌，食道鳞状细胞癌和肝细胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制肿瘤的circRNA，如胶质母细胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。还有一些circRNA在不同组织或不同细胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直肠癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌细胞的。 除了癌症，研究还发现circRNA与糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神经系统疾病都有密切的关系。相信随着生物技术的发展以及越来越多对circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用机理可以更加清晰，在疾病预防，检测及治疗方面也可以起到重要的作用。 circRNA敲除方案比较难设计，一般会使用以下两种方法： 方案一：将两条gRNA分别设计在circRNA exon的两端，直接敲除环化的外显子序列。这种方案虽然敲除彻底，但是在敲除circRNA的同时，也会影响到编码蛋白的亲本基因，需要根据具体的实验目的考虑是否可行。 方案二：通过破坏circRNA成环来达到敲除的目的。需要先找到circRNA的成环元件，成环元件一般位于被环化外显子两端的长侧翼内含子中。找到成环元件后，在两端设计gRNA进行敲除，既不破坏编码基因的外显子，又可以实现circRNA的敲除（图4.） 应用案例： circ-HIPK3是人体细胞内含量丰富的一种环状RNA，它可以与多种miRNA结合，作为细胞生长的调节剂，影响肿瘤的形成。为了验证circ-HIPK3成环的机制，需要找到侧翼内含子中的成环元件，对上下游预测的两个成环元件分别设计一对sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统将预测的成环元件进行敲除，检测circRNA表达情况是否发生变化。经过PCR和RT-QPCR验证，发现下游成环元件敲除后，circHIPK3表达明显下调，而上游成环元件敲除后，circHIPK3的表达不仅没有下调还有所升高。推测可能是上游的成环元件序列太多，预测的不准确。为了进一步验证是其他成环元件驱动的成环，将gRNA3或gRNA4分别与gRNA5或gRNA6共注射，敲除成环元件上游大片段内含子。RT-QPCR结果显示circHIPK3表达确实下降了，说明上游是由其他的成环元件起到成环的作用。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） 在研究circRNA功能的方法中，最经典的抑制circRNA的方法是通过RNAi的方式（shRNA）进行敲降。为了避免影响到mRNA，设计方案时需将干扰序列设计在反向剪接位点（BSS）处。 源井生物通过设计高效的shRNA，用慢病毒法将干扰载体转入细胞中，根据最佳药筛浓度对细胞进行药物筛选，直到对照组细胞全部死亡，获得circRNA敲降的稳定细胞株。 应用案例： 用siRNA进行敲降后，通过检测细胞增殖凋亡情况，说明circ-HIPK3敲除后抑制细胞增殖。首先设计三组实验，分别针对HIPK3 mRNA线性转录本、circ-HIPK3环状转录本和两种转录本共有部分设计siRNA，并在HEK-293 T细胞系上验证设计的siRNA只干扰相应的转录本。 利用增殖凋亡检测试剂盒：CCK-8和EdU进行细胞增殖凋亡检测，结果显示HIPK3 mRNA敲降后不明显影响细胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，会明显抑制细胞增殖。 （参考文献：Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.） circRNA过表达一直有成环效率低，容易错配成环等难点。通过优化侧翼成环框架，如成环元件、QKI等RBP的结合位点，使circRNA准确高效环化。过表达后仍需要检测是否成功成环，以及线性mRNA是否表达。为了研究一种新环状RNA 载体表达 系统的成环效率，选择小鼠circRtn4环状基因在多种细胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中进行表达验证。根据不同细胞系中进行的RT-QPCR实验数据显示，新载体系统pCircRNA-DMo-Rtn4成环效率在几种不同的细胞系中均比普通的载体系统（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。Northern Blotting是检测circRNA的金标准，探针通常跨反向剪接位点设计。但由于Northern Blotting需要的circRNA量非常大，耗时间精力，而且探针一般是放射性标记，操作上比较困难。常用的检测方案还是用RT-PCR或者是RT-QPCR，引物设计在反向剪接位点两端。（图9.）