脉络膜研究进展论文

中心性视网膜炎或称中心性浆液性视网膜脉络膜病变。临床常见症状为视物模糊，似有纱幕遮盖，或如隔云雾，视物发暗，或觉视野中央有薄薄的黑影，黑影可大可小，有时视物变异失真，外眼端好无红肿热痛。眼底检查可见黄斑区发暗，视网膜水肿，在水肿边缘有圆形、椭园形或不规划的反射光晕，约1～3个视乳头直径大小。病变区可出现黄白色或灰白色渗出小点，原来的中心凹反光消失或弥散。 本病是一种十分常见的眼底病，多发生在20～40岁青壮年，男性远较女性为多。常侵犯一只眼，偶尔也有双眼发病者，发病者与感冒、工作劳累、精神紧张、睡眠不足或过度吸烟、饮酒等有关，真正发病原因还不十分清楚。大多数学者认为，视网膜色素上皮或神经上皮损害是本病的病理学基础。本病有自愈倾向，一般预后较好，初次发病90%病人视力可恢复正常。但容易复发，如果多次复发，视力会遭到永久性损害。 由于本病的病因不明，发病机制复杂，迄今尚无有效方法，只能视病情的不同采用相应的治疗措施，目前主要有以下几种： 西药治疗：可针对全身疾病给予抗生素或磺胺类药物及多种维生素，结合血管扩张药物以解除小动脉痉挛，改善微循环，提高组织对缺氧的耐受性。常用的药物有芦丁、维生素C、维生素B族等〔9〕。也有人主张用钙剂以减少毛细血管的出血，后期可加用安妥碘肌注，但疗效均不明显。 中医药治疗：在用西药治疗的同时，宜及早配合使用中药以提高疗效。一些医家依辨证和辨病的不同，提出以下治疗方法〔10〕： 辨证论治：①肝气郁结型：治则：疏肝解郁，清热凉血。选方：丹栀逍遥散加减。②阴虚火旺型：治则：滋阴降火，活血化瘀。选方：知柏地黄汤加活血化瘀药，如黄斑病变趋于机化者加软坚散结药。③脾虚气弱型：治则：补益心脾，活血化瘀。选方：参苓白术散、归脾汤加活血化瘀药。 辨病论治：①活动期：治则：清热凉血，止血活血。②恢复期：治则：健脾益气，活血化瘀。③瘢痕期：治则：活血化瘀，软坚散结。 也有医家根据3种不同的症型，主张分而治之〔11〕：①肝气郁结型：治则：疏肝解郁，清热凉血。选方：丹栀逍遥散加减。②脾虚气弱型：治则：健脾益气，化痰利水。选方：六君子汤合四苓散加减：③肝肾阴虚型：治则：滋阴降火，凉血止血。选方：知柏地黄汤加减。 还有医家依据辨证论治提出如下方法〔12〕：①阴虚火旺：治法：滋阴降火。方药：知柏地黄汤加减。②热入血分：治法：凉血止血。方药：凉血止渗汤。③气滞血瘀：治法；行气活血。方药：逍遥散加味。④肝肾亏虚：治法：滋补肝肾。方药：杞菊地黄汤加减。 也有根据黄斑出血情况，建议如下分期治疗：①出血期：以凉血止血为主。②瘀血期：宜活血化瘀。③吸收期：在活血化瘀基础上重用黄芪以补其气，使气血运行通畅。同时加服杞菊地黄丸以补益肝肾，巩固疗效。有渗出时，可加用利水的茯苓、车前子，使渗出物吸收。因本病病情缠绵，久病必虚，后期可在软坚散结的基础上重用补气药，如黄芪、党参等以提高视力。还有不少医家提出的治疗方法在临床实践中也取得了较好的疗效〔13，14〕。 除中药外，针刺治疗本病也有一定作用，可使气机调达，气血通畅，加快出血的吸收，减少后期并发症的产生。取穴：选用球后、睛明、瞳子�NFDA1�、翳明、风池、合谷，每次选2～3穴，针刺患侧。肝郁气滞者加针支沟；肝肾阴虚者加针肝俞、肾俞、三阴交；脾虚者加针足三里。每日或隔日针1次，10次为1疗程，休息3～5d后，再进行第2疗程的治疗〔15〕。 激光疗法：荧光素眼底血管造影显示本病新生血管的侵入往往先于出血存在。临床观察用激光治疗最有效〔16，17〕。光凝治疗的目的在于增进或保留部分有用的中心视力，但选择适应证时应相当慎重，一般应对活动期的患者进行光凝治疗。应对位于毛细血管拱环外非乳头黄斑束间的新生血管进行光凝，黄斑周围的出血区禁忌光凝〔18，19，20〕。 在选用激光治疗时，对于激光的种类、波长、能量及光斑的大小等方面有不同意见。有主张用氩激光中的纯绿光，也有人指出用氪红激光治疗中心凹无血管区200μm内的脉络膜新血管效果较好，并可避免损伤感光细胞。但有认为在治疗由组织胞浆菌病所致中渗的中心凹外脉络膜新生血管时，氪红激光的疗效并不优于氩绿激光〔21〕。 冀天恩等〔22〕对60例患者的治疗进行了临床分析，其中渗出灶位于黄斑中心凹或其边缘，如行激光凝固必然使中心凹受到破坏，只有少数位于中心凹以外的病灶可望取得较好的效果，故激光治疗的适应证范围是很小的。 手术治疗：目前，本病尚无特效药物可控制其发展，而激光治疗又有以下缺点：①中心凹下及中心凹旁的视网膜下新生血管(subretinal neovasculature,SRNV)限制了激光治疗的实施；②激光治疗后SRNV的复发率相当高，且向中心凹下发展；③当SRNV表面有较大量出血时，激光治疗难以进行〔23〕。为此，国内外许多学者开展了SRNV及出血的手术治疗，但其适应证各学者标准不一。Lamber〔24〕的手术指征是：①明确的中心凹下及整个黄斑中心凹无血管拱环内的新生血管形成和/或出血；②最佳矫正视力≤20/200；③术前处于最少的视网膜下出血状态；④伴有渗出性黄斑脱离。对符合以上条件的自愿患者可实施手术治疗。Berger〔25〕的手术指征是：①FFA证实黄斑中心凹下有新生血管形成；②术前最佳矫正视力明显下降，通常到20/200～20/400；③无黄斑中心凹光凝史及Humphrey 30-2型视野测试有中心暗点；④新生血管范围小于3 DD；⑤无其他导致视力明显下降的眼疾；⑥患者自愿手术。其它学者的手术指征均大同小异。 我国于90年代初开展了黄斑下脉络膜新生血管膜手术治疗的临床研究〔26〕，常用的方法为玻璃体切割术，如掌握好适应证，不失为一种可行的治疗方法。SRNV及出血的手术治疗使玻璃体视网膜手术跃上了一个新的水平。但该手术的广泛应用有待于色素上皮移植的成功、简化；超显微手术的推广和普及以及t-PA应用的进一步研究〔27，28〕。 4 总结 依据患者的临床表现，结合眼底检查和荧光素眼底血管造影分析，一般可对中心性渗出性脉络膜视网膜炎作出明确的诊断。但由于本病的病因、病机不明，目前尚无特异和有效的治疗方法。采用中、西药物治疗的方法在一定程度上可以缓解症状，减少出血和渗出，防止和减轻视网膜下新生血管的形成，实践证明这是一种较为行之有效的方法。激光治疗可以封闭新生血管的出血，减少后续并发症的发生，但要从严掌握适应证。手术治疗有待于进一步探索和推广。可以相信，随着对中心性渗出性脉络膜视网膜炎研究的不断深化和新的诊疗技术的不断涌现，中西医结合治疗中心性渗出性脉络膜视网膜炎将会展现出更美好的前景。常见的眼底病，多发生在20～40岁青壮年，男性远较女性为多。常侵犯一只眼，偶尔也有双眼发病者，发病者与感冒、工作劳累、精神紧张、睡眠不足或过度吸烟、饮酒等有关，真正发病原因还不十分清楚。大多数学者认为，视网膜色素上皮或神经上皮损害是本病的病理学基础。本病有自愈倾向，一般预后较好，初次发病90%病人视力可恢复正常。但容易复发，如果多次复发，视力会遭到永久性损害。 助抗渗出，神经营养等治疗，效果还不错，就是比较慢，看过相关资料，讲不用治疗半年左右会自愈 楼上的几位都是复制的!!! 我劝您千万别上当!他们给的答案根本治不好您的病! 因此我强烈建议您去一些比较有权威性的眼科医院咨询那里的医生!

从简单地剪切致病基因，到开发出不再传播疾病的工程动物，基因编辑技术已经释放出巨大的潜力。随着研究的深入，科学界还发现，除了编辑具有遗传讯息的DNA片段，编辑RNA可以在不改变基因组的情况下，帮助调整基因表达方式，此外，RNA的寿命是相对短暂的，这也意味着它的变化是可以逆转的，从而避免基因工程中的巨大风险。

2017年10月，来自Broad研究所的张锋研究团队在《自然》期刊上发表了题为“RNA targeting with CRISPR-Cas13”的文章，首次将CRISPR-Cas13系统公之于众，证实了CRISPR-Cas13可以靶向哺乳动物细胞中的RNA。仅仅时隔三周，又一篇名为“RNA editing with CRISPR-Cas13”的力作发表于《科学》期刊。在该研究中，张锋研究团队再次展示了这一RNA编辑系统，能有效地对RNA中的腺嘌呤进行编辑。

在CRISPR出现之前，RNAi是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a酶一大优势在于更强的特异性，而且这种本身来自细菌的系统对哺乳动物细胞来说，并不是内源性的，因此不太可能干扰细胞中天然的转录。相反，RNAi利用内源性机制进行基因敲除，对本身的影响较大。但CRISPR-Cas13系统还有一个重要的问题，Cas13a酶本质上是一种相对较大的蛋白质，因此很难被包装到靶组织中，这也可能成为RNA编辑技术临床应用的一大障碍。

2018年3月16日，一项发表在《细胞》期刊的重磅成果为RNA编辑技术带来一大步飞跃，来自美国Salk研究所的科学家利用全新的CRISPR家族酶扩展了RNA编辑能力，并将这个新系统命名为“CasRx”。

CasRx（品红色）在人类细胞核中靶向RNA（灰色），Salk研究所

“生物工程师就像自然界的侦探一样，在DNA模式中寻找线索来帮助解决遗传疾病。CRISPR彻底改变了基因工程，我们希望将编辑工具从DNA扩展到RNA。”研究领导者Patrick Hsu博士表示，“RNA信息是许多生物过程的关键介质。在许多疾病中，这些RNA信息失去了平衡，因此直接靶向RNA的技术将成为DNA编辑的重要补充。”

除了高效性且无明显脱靶效应，新系统的一个关键特征是其依赖于一种比以前研究中物理尺寸更小的酶。 这对RNA编辑技术至关重要，这使得该编辑工具能够更容易被包装到病毒载体，并进入细胞进行RNA编辑。来自东京大学的科学家Hiroshi Nishimasu并未参与这项研究，他表示：“在这项研究中，研究人员发现了一种较Cas13d更加‘紧凑’的酶CasRx。从基础研究到治疗应用，我认为CasRx将成为非常有用的工具。”

此外，在这项研究中，研究人员还展示了利用这种新型RNA编辑系统来纠正RNA过程的能力。他们将CasRx包装到病毒载体中，并将其递送到利用额颞叶痴呆（FTD）患者干细胞中培养的神经细胞，最终使tau蛋白水平恢复到健康水平上，有效率达到80%。

Patrick Hsu博士最后说道：“基因编辑技术通过对DNA的切割带来基因序列的改变。在经过基因编辑的细胞中，其效果是永久的。虽然基因编辑技术能够很好地将基因完全关闭，但对调节基因的表达上并不那么优秀。展望未来，这一最新工具将在RNA生物学研究中发挥重要作用，并有望在未来凭借该技术对RNA相关疾病进行治疗。”

该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默。

3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向Pten基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了Pten的高效沉默，证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性，通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向Pscsk9的sgRNA到小鼠肝脏，有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低Pten的质粒、尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒、眼部注射敲低Vegfa的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到Pten基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调，Pcsk9下调造成血清胆固醇下调；Vegfa下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

2020年3月18日，《蛋白质与细胞》期刊在线发表了《Cas13d介导的肝脏基因表达下调对代谢功能的调控》的研究论文，该研究由中科院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杨辉研究组和上海科技大学生命科学与技术学院黄鹏羽研究组合作完成。该研究探索了Cas13d家族蛋白CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合，通过尾静脉注射质粒的方式，将CasRx系统和靶向 Pten 基因的sgRNA导入到小鼠肝脏细胞中，成功在小鼠肝脏中实现了 Pten 的高效沉默， 证实了CasRx系统在成体动物体内也具有靶向沉默RNA的活性， 通过增强下游蛋白AKT的磷酸化，影响了糖脂代谢相关基因的表达。同时，利用AAV递送CasRx和靶向 Pscsk9 的sgRNA到小鼠肝脏， 有效降低了肝脏中PCSK9的蛋白表达，以及小鼠血液中的胆固醇水平 。这为治疗后天性的代谢疾病提供了新方案。

同时，杨辉研究组与上海交通大学医学院附属上海第一人民医院孙晓东研究组合作，也 探究了CasRx预防严重的眼部疾病——年龄相关性黄斑变性（AMD）的可能性，研究人员发现在体内使用CasRx敲低 Vegfa的mRNA可以显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积**，验证了将RNA靶向的CRISPR系统用于治疗应用的潜力。相关研究论文《CasRx介导的RNA靶向策略可防止年龄相关的黄斑变性的小鼠模型中的脉络膜新生血管形成》3月3日在《国家科学评论》在线发表。

近年来，CRISPR/Cas9技术因其强大且便捷的DNA编辑能力而受到广泛关注。2016年，张锋实验室发现了一种新的Cas蛋白Cas13a，可以靶向RNA进行切割。之后人们又陆续发现了靶向RNA的Cas13b, Cas13c。由于Cas13家族蛋白靶向RNA的特点，理论上在一些特定疾病的检测和治疗上具有独特优势，因而成为近年来的研究热点。2018年，加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现了Cas13d家族。他们发现与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比， Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％ ，shRNA达到65％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比， Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的 ，从而对一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病）的治疗更有优势。其中Cas13d家族的CasRx蛋白由于体积小，效率高，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白。

此前的工作都在细胞水平证明了CasRx的高效性和特异性，杨辉研究组的这两篇文章则更进一步在动物体内证明了CasRx的活性，为临床提供了可能性 。为证明CasRx在动物体内的活性，研究人员分别针对目的基因进行了sgRNA的体外筛选，然后采用尾静脉注射敲低 Pten 的质粒、尾静脉注射敲低 Pcsk9 的AAV8病毒、眼部注射敲低 Vegfa 的AAV病毒。对注射后的小鼠进行相应分析，分别得到 Pten 基因下调及其下游蛋白AKT的磷酸化上调， Pcsk9 下调造成血清胆固醇下调； Vegfa 下调显著减少AMD小鼠模型中脉络膜新血管形成（CNV）的面积。

图1 CasRx介导的 Pten 体内体外的下调（ Protein & Cell ）

A.质粒示意图；细胞中 Pten 的下调；检测PTEN及AKT的表达； 与shRNA脱靶比较；E.尾静脉注射质粒示意图；.免疫荧光，qPCR，western分别检测 Pten 及p-AKT的表达

图2 血清胆固醇的调节以及 Pcsk9 的可逆调控（ Protein & Cell ）

A.针对 Pcsk9 的AAV8病毒注射示意图；B.肝组织中 Pcsk9 的表达量；C.血清 PCSK9 的表达量；D.血清胆固醇水平；.血清ALT和AST的测定；G.可逆调节注射示意图； H. Pcsk9 的动态调控。

图3 AAV介导CasRx减少了AMD小鼠模型中CNV的面积（National Science Review）

A.小鼠和人序列比较以及sgRNA示意图；.在293T和N2a细胞中敲低 Vegfa ；蛋白的表达；病毒质粒示意图；F.实验流程图；的mRNA表达水平；.激光烧伤之前或之后7天的 Vegfa mRNA水平；诱导3天后的VEGFA蛋白水平；K.激光烧伤7天后，用PBS或AAV-CasRx- Vegfa 注射的代表性CNV图像；面积统计。

2020 年 4 月 8 日， Cell 期刊在线发表了题为 《Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice》 的研究论文，该研究由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室 杨辉 研究组完成。

该项研究通过运用最新开发的 RNA 靶向 CRISPR 系统 CasRx 特异性地在视网膜穆勒胶质细胞中敲低 Ptbp1 基因的表达，首次在成体中实现了视神经节细胞的再生，并且恢复了永久性视力损伤模型小鼠的视力。同时，该研究还证明了这项技术可以非常高效且特异地将纹状体内的星形胶质细胞转分化成多巴胺神经元，并且基本消除了帕金森疾病的症状。该研究将为未来众多神经退行性疾病的治疗提供一个新的途径。

人类的神经系统包含成百上千种不同类型的神经元细胞。在成熟的神经系统中，神经元一般不会再生，一旦死亡，就是永久性的。神经元的死亡会导致不同的神经退行性疾病，常见的有阿尔兹海默症和帕金森症。此类疾病的病因尚不明确且没有根治的方法，因此对人类的健康造成巨大威胁。据统计，目前全球大约有 1 亿多的人患有神经退行性疾病，而且随着老龄化的加剧，神经退行性疾病患者数量也将逐渐增多。

在常见的神经性疾病中，视神经节细胞死亡导致的永久性失明和多巴胺神经元死亡导致的帕金森疾病是尤为特殊的两类，它们都是由于特殊类型的神经元死亡导致。我们之所以能看到外界绚烂多彩的世界，是因为我们的眼睛和大脑中存在一套完整的视觉通路，而连接眼睛和大脑的神经元就是视神经节细胞。

作为眼睛和大脑的唯一一座桥梁，视神经节细胞对外界的不良刺激非常敏感。研究发现很多眼疾都可以导致视神经节细胞的死亡，急性的如缺血性视网膜病，慢性的如青光眼。视神经节细胞一旦死亡就会导致永久性失明。据统计，仅青光眼致盲的人数在全球就超过一千万人。

帕金森疾病是一种常见的老年神经退行性疾病。它的发生是由于脑内黑质区域中一种叫做多巴胺神经元的死亡，从而导致黑质多巴胺神经元不能通过黑质-纹状体通路将多巴胺运输到大脑的另一个区域纹状体。目前，全球有将近一千万人患有此病，我国尤为严重，占了大约一半的病人。 如何在成体中再生出以上两种特异类型的神经元，一直是全世界众多科学家努力的方向。

该研究中，研究人员首先在体外细胞系中筛选了高效抑制 Ptbp1 表达的 gRNA，设计了特异性标记穆勒胶质细胞和在穆勒胶质细胞中表达 CasRx 的系统。所有元件以双质粒系统的形式被包装在 AAV 中并且通过视网膜下注射，特异性地在成年小鼠的穆勒胶质细胞中下调 Ptbp1 基因的表达。

大约一个月后，研究人员在视网膜视神经节细胞层发现了由穆勒胶质细胞转分化而来的视神经节细胞，并且转分化而来的视神经节细胞可以像正常的细胞那样对光刺激产生相应的电信号。

研究人员进一步发现，转分化而来的视神经节细胞可以通过视神经和大脑中正确的脑区建立功能性的联系，并且将视觉信号传输到大脑。在视神经节细胞损伤的小鼠模型中，研究人员发现转分化的视神经细胞可以让永久性视力损伤的小鼠重新建立对光的敏感性。

为进一步发掘 Ptbp1 介导的胶质细胞向神经元转分化的治疗潜能，研究人员证明了该策略还能特异性地将纹状体中的星形胶质细胞非常高效的转分化为多巴胺神经元，并且证明了转分化而来的多巴胺神经元能够展现出和黑质中多巴胺神经元相似的特性。

在行为学测试中，研究人员发现这些转分化而来的多巴胺神经元可以弥补黑质中缺失的多巴胺神经元的功能，从而将帕金森模型小鼠的运动障碍逆转到接近正常小鼠的水平。

需要指出的是，虽然科学家们在实验室里取得了重要进展，但是要将研究成果真正应用于人类疾病的治疗，还有很多工作要做：人类的视神经节细胞能否再生？帕金森患者是否能通过该方法被治愈？这些问题有待全世界的科研工作者共同努力去寻找答案。

（上）CasRx 通过靶向的降解 Ptbp1 mRNA 从而实现 Ptbp1 基因表达的下调。

（中）视网膜下注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将视网膜穆勒胶质细胞转分化为视神经节细胞，转分化而来视神经节细胞可以和正确的脑区建立功能性的联系，并且提高永久性视力损伤模型小鼠的视力。

（下）在纹状体中注射 AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1 可以特异性的将星形胶质细胞转分化为多巴胺神经元，从而基本消除了帕金森疾病模型小鼠的运动症状。

RNA-editing Cas13 enzymes have taken the CRISPR world by storm. Like RNA interference, these enzymes can knock down RNA without altering the genome , but Cas13s have higher on-target specificity. New work from Konermann et al. and Yan et al. describes new Cas13d enzymes that average only kb in size and are easy to package in low-capacity vectors! These small, but mighty type VI-D enzymes are the latest tools in the transcriptome engineering toolbox.

Microbial CRISPR diversity is impressive, and researchers are just beginning to tap the wealth of CRISPR possibilities. To identify Cas13d, both groups used very general bioinformatic screens that looked for a CRISPR repeat array near a putative effector nuclease. The Cas13d proteins they identified have little sequence similarity to previously identified Cas13a-c orthologs, but they do include HEPN nuclease domains characteristic of the Cas13 superfamily. Yan et al. proceeded to study orthologs from Eubacterium siraeum (EsCas13d) and Ruminococcus sp. (RspCas13d), while Konermann et al. characterized orthologs from “Anaerobic digester metagenome” (AdmCas13d) and Ruminococcus flavefaciens (nicknamed CasRx), as well as EsCas13d.

Like other Cas13 enzymes, the Cas13d orthologs described in these papers can independently process their own CRISPR arrays into guide RNAs. crRNA cleavage is retained in dCas13d and is thus HEPN-independent. These enzymes also do not require a protospacer flanking sequence, so you can target virtually any RNA sequence ! In bacteria, Cas13d-mediated cleavage promotes collateral cleavage of other RNAs. As with other Cas13s, this collateral cleavage does not occur when Cas13d is expressed in a mammalian system.

Since Cas13d is functionally similar to previously discovered Cas13 enzymes - what makes these orthologs so special? The first property is size - Cas13d enzymes have a median length of ~930aa - making them 17-26% smaller than other Cas13s and a whopping 33% smaller than Cas9! Their small size makes then easy to package in low-capacity vectors like AAV, a popular vector due to its low immunogenicity. But these studies also identified other advantages, including Cas13d-specific regulatory proteins and high targeting efficiency, both of which are described below.

The majority of Type VI-D loci contain accessory proteins with WYL domains (named for the three conserved amino acids in the domain). Yan et al. from Arbor Biotechnologies found that RspCas13d accessory protein RspWYL1 increases both targeted and collateral RNA degradation by RspCas13d. RspWYL1 also increased EsCas13d activity, indicating that WYL domain-containing proteins may be broader regulators of Cas13d activity. This property makes WYL proteins an intriguing counterpart to anti-CRISPR proteins that negatively modulate the activity of Cas enzymes, some of which are also functional in multiple species (read Arbor Biotechnologies' press release about their Cas13d deposit here ).

Not all Cas13d proteins are functional in mammalian cells, but Konermann et al. saw great results with CasRx and AdmCas13d fused to a nuclear localization signal (NLS). In a HEK293 mCherry reporter assay, CasRx and AdmCas13d produced 92% and 87% mCherry protein knockdown measured by flow cytometry, respectively. Cas13d CRISPR array processing is robust, with CasRx and either an unprocessed or processed gRNA array (22 nt spacer with 30 nt direct repeat) mediating potent knockdown. Multiplexing from the CRISPR array yielded >90% knockdown by CasRx for each of four targets, including two mRNAs and two nuclear long non-coding RNAs.

One interesting twist to Cas13d enzymes is their cleavage pattern: EsCas13d produced very similar cleavage products even when guides were tiled across a target RNA, indicating that this enzyme does not cleave at a predictable distance from the targeted region. Konermann et al. show that EsCas13d favors cleavage at uracils, but a more detailed exploration of this cleavage pattern is necessary.

Konermann et al. compared CasRx to multiple RNA regulating methods: small hairpin RNA interference, dCas9-mediated transcriptional inhibition (CRISPRi), and Cas13a/Cas13b RNA knockdown. CasRx was the clear winner with median knockdown of 96% compared to 65% for shRNA, 53% for CRISPRi, and 66-80% for other Cas13a and Cas13b effectors. Like previously characterized Cas13 enzymes, CasRx also displays very high on-target efficiency; where shRNA treatment produced 500-900 significant off-targets, CasRx displayed zero. Unlike Cas9, for which efficiency varies widely across guide RNAs, each guide tested with CasRx yielded >80% knockdown. It seems that CasRx may make it possible to target essentially any RNA in a cell.

Since catalytically dead dCasRx maintains its RNA-binding properties, Konermann et al. tested its ability to manipulate RNA species through exon skipping. Previous CRISPR exon-skipping approaches used two guide RNAs to remove a given exon from the genome, and showed success in models of muscular dystrophy . In this case, Konermann et al. targeted MAPT , the gene encoding dementia-associated tau, delivering dCasRx and a 3-spacer array targeting the MAPT exon 10 splice acceptor and two putative splice enhancers. After AAV-mediated delivery to iPS-derived cortical neurons, dCasRx-mediated exon skipping improved the ratio of pathogenic to non-pathogenic tau by nearly 50%, showing proof-of-concept for pre-clinical and clinical applications of dCasRx.

The identification of Type VI Cas13d enzymes is another win for bioinformatic data mining. As we continue to harness the natural diversity of CRISPR systems, only time will tell how large the genome and transcriptome engineering toolbox will be. It is, however, certain that the impact of CRISPR scientific sharing will continue to grow, and we at Addgene appreciate our depositors for making their tools available to the broader community.

References

Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1. PubMed PMID: 29551272

Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4. PubMed PMID: 29551514

\1. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors

\2. CRISPR genetic editing takes another big step forward, targeting RNA

\3. How Editing RNA—Not DNA—Could Cure Disease in the Future

[ ](

常见的眼底病，多发生在20～40岁青壮年，男性远较女性为多。常侵犯一只眼，偶尔也有双眼发病者，发病者与感冒、工作劳累、精神紧张、睡眠不足或过度吸烟、饮酒等有关，真正发病原因还不十分清楚。大多数学者认为，视网膜色素上皮或神经上皮损害是本病的病理学基础。本病有自愈倾向，一般预后较好，初次发病90%病人视力可恢复正常。但容易复发，如果多次复发，视力会遭到永久性损害。助抗渗出，神经营养等治疗，效果还不错，就是比较慢，看过相关资料，讲不用治疗半年左右会自愈

胸膜是一层浆膜，覆盖于肺表面及胸廓内侧面，分别称为脏层及壁层胸膜，两层胸膜围成一个间隙，称为胸膜腔。在正常情况下，胸膜腔内仅含少量浆液，起润滑作用，减少两层胸膜间摩擦作用，防止粘连。胸膜炎是胸膜的炎症，可由于感染（细菌、病毒、霉菌、阿米巴、肺吸虫等）、肿瘤、变态反应、化学性和创伤性等多种疾病所引起。在细菌感染所致的胸膜炎中，结核菌性胸膜炎是最常见的一种胸膜炎。结核性胸膜炎，属于肺结核病五大类型的V型，其虽非肺部病变，但在临床上与肺结核有密切的关系。 祖国医学认为结核性胸膜炎不属肺痨范畴，当属"胸痛、咳嗽、发热”等范畴，故治则方药与肺痨也不相同。 病因病机 现代医学认为，结核性胸膜炎是由结核菌及其代谢产物进入正处于高度过敏状态的机体胸膜腔中所引起的胸膜炎症。为儿童和青少年原发感染或继发结核病累及胸膜的后果。此时肺内可同时有或无明显结核病灶，发现结核菌到达胸膜腔的途径有三： 病变直接蔓延。 淋巴播散。 血行播散。 当机体处于高度变态反应状态，结核菌及其代谢产物侵入胸膜，则引起渗出性胸膜炎。当机体对结核菌过敏反应较低，则只形成局限性纤维素性胸膜炎（即干性胸膜炎）。少数病人由干性胸膜炎进展为渗出性胸膜炎，胸膜炎症早期先有胸膜充血、水肿和白细胞浸润占优势，随后淋巴细胞转为多数，胸膜内皮细胞脱落，其表面有纤维蛋白渗出，继而桨液渗出，形成胸腔积液，胸膜常有结核性结节形成。 祖国医学认为，外感阳热之邪、邪正相抗、阳盛于外，故发热畏寒；热乘于上，首取犯肺，肺失清肃则咳嗽；血乃属阴，赖阳气以运行，气行血亦行，气滞则血凝。邪毒蕴结于肺，阻碍气机，脉络瘀滞血运不畅，以致不通则痛，故胸痛剧烈，似针锥之状，随活动而加剧，元气亏耗，肌腠驰松、津失气摄、则容易出汗，身体衰弱无力；饮停于胸、清阳失于输布、肺气受损、肺络阳气不充；则气促、紫绀，端坐呼吸而不能平卧。 临床表现 结核性胸膜炎多发生于儿童和40岁以下的青壮年，按病理解剖可分为干性胸膜炎和渗出性胸膜炎两大类。 （一）、干性胸膜炎可发生于胸膜腔的任何部分。 其症状轻重不一，有些病人很少或完全没有症状，而且可以自愈。有的人起病较急，有畏寒，轻度或中度低烧，但主要症状是局限性针刺样胸痛。胸痛系因壁层和脏层胸膜互相贴近摩擦所致，故胸痛多位于胸廓呼吸运动幅度最大的腋前线或腋后线下方，深呼吸和咳嗽时胸痛更甚。如病变发生于肺尖胸膜，胸痛可沿臂丛放射，使手疼痛和知觉障碍，如在膈肌中心部，疼痛可放射到同侧肩部；病变在膈肌周边部，疼痛可放射至上腹部和心窝部。由于胸痛病人多不敢深吸气，故呼吸急促而表浅，当刺激迷走神经时可引起顽固性咳嗽。查体可见呼吸运动受限，局部有压痛，呼吸音减低，触到或听到胸膜摩擦音，此音不论呼气或吸气时均可听到而咳嗽后不变为其特点。此时，胸膜摩擦音为重要体征。 （二）、结核性渗出性胸膜炎。 病变多为单侧，胸膜腔内有数量不等的渗出液，一般为浆液性，偶见血性或化脓性。 按其发生部位可分为：肋胸膜炎（又称典型胸膜炎）包裹性胸膜炎，叶间胸膜炎，纵膈胸膜炎，膈胸膜炎，肺尖胸膜炎。 典型渗出性胸膜炎起病多较急，有中度或高度发烧、乏力、盗汗等结核中毒症状，发病初期有胸痛，多为刺激性剧痛，随胸液出现和增多，因阻碍壁层和脏层胸膜的互相摩擦，胸痛反而减轻或消失。但可出现不同程度的气短和呼吸困难。 病初多有刺激性咳嗽，痰量通常较少，转移体位因胸液刺激胸膜可引起反射性干咳。体征随胸液多少而异，少量胸液可无明显体征。积液吸收后，往往遗留胸膜粘连或增厚。 在经得患者本人同意的情况下,现将部分病例介绍给大家,以供参考 吴子良 男 18岁 辽宁抚顺 就诊时间：2001年6月21日 因胸痛、发烧检查发现结核性胸膜炎，因学习紧张治疗不及时胸水反复出现，治疗一月余抽了几次水共计约1500毫升左右。后来每次只能抽出几十毫升，经胸片检查：包裹性胸膜炎，保守治疗没有办法，只能靠自己吸收，必要时手术处理。来诊：给清胸祛痨丸一疗程，服完后复查。复查：右下半圆形阴影较前片明显缩小。继续服第二疗程。复查：右下胸膜肥厚。继续服第三疗程。复查：右下胸膜少许肥厚。告痊愈。又服一疗程巩固疗效。 典型病例: 宋达美 女 33岁 黑龙江佳木斯 就诊时间2001年6月17日 包裹性胸膜炎半年，因药物性肝炎停服抗结核西药，辗转服中药治疗两月余，不见疗效。来诊：右下包裹性胸膜炎×。给清胸祛痨丸两疗程，服完后复查。复查：右下包裹积液×。再服两疗程。复查：右下局部胸膜肥厚。再服一疗程巩固。告痊愈。 韩理财 男 32岁 黑龙江大庆 就诊时间2001年7月18日 来诊前有盗汗、深呼吸胸痛等症状。拍片显示少量胸水，B超定位抽出约500毫升胸水。诊断：结核性胸膜炎。接受抗结核正规治疗近两个月，时有胸痛，复查胸水未完全消失。来诊给予清胸祛痨丸，抗结核药继续使用。服用一疗程后复查，肋膈角欠锐，B超证实胸水已吸收。再服一疗程复查胸水消失，胸膜少许肥厚，为临床治愈。建议西药服至疗程结束。 潘启亮 男 44岁 山东淄博 就诊时间2001年8月10日 于1998年5月患结核性胸膜炎，有少量胸水。在地方防治所治疗六个月，用药为：利福平、异烟肼、乙胺丁醇。12月份再次发烧、胸闷，检查胸腔积液复发，抽出约800毫升。用药为：利福喷丁、乙胺丁醇、异烟肼。治疗两个月，抽水四次，其后转氨酶升高，停服西药故来诊。给清胸祛痨丸治疗，嘱其连用两疗程复查。两疗程复查：胸水完全吸收，胸膜肥厚粘连。为临床治愈。再给两疗程巩固疗效。 刘 某 女 24岁 梨树县桑树台镇 就诊时间:1999年4月5日 在省医院确诊右侧包裹性胸膜炎,多种抗痨药物联合使用,并胸膜腔注射异烟肼地塞米松一月余，仍未见明显疗效，后来我院就诊，采用清胸祛痨丸保守治疗，两疗程后，X光显示右侧胸膜增厚，B超检查无积液，嘱其再服一疗程以巩固疗效。