恰恰小资
浅谈蛋白质折叠的有关问题 [关键字]生物 大分子 分子伴侣 蛋白质的折叠 识别 结合 生物大分子的结构与功能的研究是了解分子水平的先象的基础。没有对生物大分子的结构与功能的认识，就没有分子生物学。正如没有DNA双螺旋结构的发现，就没有遗传传达传递的中心法则，也就没有今天的分子生物学。结构分子以由第一分子进入对复和物乃至多亚基，多分子复和体结构研究。同时，过去难以研究的分子水平上的生命运动情况也随着研究的深入和技术手段的发展而逐渐由难点变为热点。蛋白质晶体学研究已从生物大分子静态（时间统计）的结构分析开始进入动态（时间分辨）的结构分析及动力学分析。第十三届国际生物物理大会的25个专题讨论会中有一半以上涉及蛋白质的结构与功能，而“结构与功能”又强调“动力学（Dynamics）”，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系，以及对大分子相互作用的贡献。 蛋白质折叠问题被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题，在这一领域中，近年来的新发现对新生肽段能够自发进行折叠的传统概念做了根本的修正。这其中，X射线晶体衍射和各种波谱技术以及电子显微镜技术等发挥了极其重要的作用。第十三届国际生物物理大会上，Nobel奖获得者Ernst在报告中强调指出，NMR用于研究蛋白质的一个主要优点在于它能极为详细的研究蛋白质分子的动力学，即动态的结构或结构的运动与蛋白质分子功能的关系。目前的NMR技术已经能够在秒到皮秒的时间域上观察蛋白质结构的运动过程，其中包括主链和侧链的运动，以及在各种不同的温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程。蛋白质大分子的结构分析也不仅仅只是解出某个具体的结构，而是更加关注结构的涨落和运动。例如，运输小分子的酶和蛋白质通常存在着两种构象，结合配体的和未结合配体的。一种构象内的结构涨落是构象转变所必需的前奏，因此需要把光谱学，波谱学和X射线结构分析结合起来研究结构涨落的平衡，构象改变和改变过程中形成的多种中间态，又如，为了了解蛋白质是如何折叠的，就必须知道折叠时几个基本过程的时间尺度和机制，包括二级结构（螺旋和折叠）的形成，卷曲，长程相互作用以及未折叠肽段的全面崩溃。多种技术用于研究次过程，如快速核磁共振，快速光谱技术（荧光，远紫外和近紫外圆二色）。 一、新生肽段折叠研究中的新观点 长期以来关于蛋白质折叠，形成了自组装（self-assembly）的主导学说，因此，在研究新生肽段的折叠时，就很自然的把在体外蛋白质折叠研究中得到的规律推广到体内，用变性蛋白的复性作为新生肽段折叠的模型，并认为细胞中新合成的多肽链，不需要别的分子的帮助，不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的功能状态。 1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。九十年代一类具有新的生物功能的蛋白，分子伴侣（Molecularchaperone）的发现，以及在更广泛意义上说的帮助蛋白质折叠的辅助蛋白(Accessoryprotein)的提出，说明细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。 二、蛋白质分子的折叠和分子伴侣的作用 蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键共同作用。因此新生肽段在一边合成一边折叠过程中有可能暂时形成在最终成熟蛋白中不存在不该有的结构，他们常常是一些疏水表面，它们之间很可能发生本不应该有的错误的相互作用而形成的非功能的分子，甚至造成分子的聚集和沉淀。按照自组装学说，每一步折叠都是正确的，充分的，必要的。实际上折叠过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程，为了提高蛋白质生物合成的效率的，应该有帮助正确途径的竞争机制，分子伴侣就是这样通过进化应运而生的。它们的功能是识别新生肽段折叠过程中暂时暴露的错误结构的，与之结合，生成复和物，从而防止这些表面之间过早的相互作用，阻止不正确的非功能的折叠途径，抑制不可逆聚合物产生，这样必然促进折叠向正确方向进行。（从哲学的观点说，似乎很容易驳斥自组装学说，它违背了矛盾的普遍性原理，试想，如果蛋白质的每一步折叠均是正确的，充分的，必要的，岂不是在无任何矛盾的前提下，完成了复杂的最稳定构象的形成，即完成了由量变到质变的伟大飞跃，从无活性的肽链变成有活性的功能蛋白，这显然是违背哲学基本原理的。换一个角度想，生物进化的过程本来就充满着不定向的变异，这些变异中有适应环境的，也有不适应环境的，“物竞天择”，自然的选择淘汰了那些不适应的，保留了那些适应的。蛋白质分子的折叠不也与此类似吗？我想，蛋白质的一级结构只是肽链折叠并形成功能蛋白的特定三维结构的内因，实际上，多肽链在形成活性蛋白的每一步，都有潜在的可能形成“不正确”的折叠，如果没有象分子伴侣或其它帮助蛋白等外部因素的作用，多肽链也永远不能折叠成为活性蛋百。） 三，分子伴侣的作用机制 分子伴侣的作用机制实际上就是它如何与靶蛋白识别，结合，又解离的机制。有的分子伴侣具高度专一性，如一些分子内分子伴侣，还有细菌Pseudomonascepacia的酯酶，有它自己的“私有分子伴侣”。它是由基因limA编码的，与酯酶的基因LipA只隔3个碱基，可能是进化过程中发生的基因分裂造成的。而一般的分子伴侣识别特异性不高，它是怎样识别需要它帮助的对象的呢？现在只能说分子伴侣识别非天然构象，而不去理会天然的构象。由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽段的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应该存在于分子内部的疏水表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合，如硫氰酸酶（Rhodanese）分子α-helix的疏水侧面。但是只有β-sheet结构的蛋白质才可为分子伴侣识别。 最近关于识别机制有较大的进展。Bip是内质网管腔内的分子伴侣，用一种affinitypanning的方法检查Bip与有随机序列的十二肽结合的特异性，结果发现，Hy-(W/X)-Hy-X-Hy-X-Hymotif与Bipj结合最强，Hy最多的是Trp、Leu、Phe，即较大的疏水残基。一般来说，2-4个疏水残基就足够进行结合。还有一种较普遍的说法是分子伴侣识别所谓熔球体结构（moltenglobule）。另一方面，分子伴侣本身与肽结合部位的结构分析最近也有些进展。譬如，PapD的晶体结构表明，多肽结合在它的β-sheet区。GroEL中，约40kD的153-531结构域是核苷酸的结合区。 分子伴侣作用的第二步是与靶蛋白形成复合物。非常盛行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚`体形式而形成中心空洞的结构，用电子显微镜已经观察到由二圈层圆面包圈形组成的十四体GroEL分子和一个一层圆面包圈的七体GroES分子协同作用形成中空的非对称笼状结构（cagemodel），推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。但是不久前一个日本实验室发现GroEL的一个亚基，甚至其N端去除78个氨基酸残基的50kD片段，已经不能再组装成十四体结构，都有确定的分子伴侣功能。由此，我想:也许环状分子伴侣并非每个部位都是有效的结合部位，也就是说，该二层圆面包圈组成的十四体GroEL分子只有一个或若干个部位能够与疏水残基或所谓的熔球体结构结合，而其余部位起识别作用，就像一个探测器一样，整个十四体GroEL分子以圈层或笼状结构”包裹”在多肽链的主链上，以旋进方式再多肽链的链体上运动，一旦环状多聚体的某一识别部位发现疏水结构或所谓的熔球体结构等新生肽链折叠过程中暂时暴露的错误结构，经信号转导，多聚体的结合部位便与之结合，生成复合物，抑制不正确的折叠。以上完全是我个人的猜想，是基于上述两个试验现象的矛盾而试图作一番解释。至于为什么假设以旋进方式在多肽链上运动，我并没有相应的根据，只是觉得这应该是一个动态过程，因此作了一番狂妄的假想,另外，我觉得也许可以用X射线衍射来探测一下分子伴侣GroEL和GroES组成的笼状结构，看看它的a×b×c是否足以容纳多肽链的某一段，或者它的内部和外部的疏水性质和其他一些物化性质如何，也许可以找到支持或驳斥上述假设的证据。 以上谈的都是蛋白质的分子伴侣。不久前又出现了一个新名词“DNAchaperones”，DNA分子伴侣，这种分子伴侣是与DNA相结合并帮助DNA折叠的。在这种复合物中，DNA分子包围在蛋白质分子的表面，既是高度有序的，又是在一定程度上结构已有所改变的。DNA与蛋白的这种相互作用对DNA的转录，复制以及重组都十分重要;或如在核小体中，对DNA的包装是必须的。DNA在溶液中的结构有相当的刚性，必须克服一个能障才能转变成它的蛋白复合物中的结构，分子伴侣的作用就是帮助DNA分子进行折叠和扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结构的特定构型中。这种结合是协同的，可逆的在形成复合物之后便解离下来。因此，不论是DNA分子伴侣还是蛋白分子伴侣，都与DNA和蛋白的相互作用有关，与基因调控有关，看来，分子伴侣确实与最终阐明中心法则当前主要问题有密切关系。 四、分子伴侣和酶的区别 与分子伴侣不同，以确定为帮助蛋白质折叠的酶目前只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI);另一个是肽基脯氨酸顺反异构酶(peptidylprolylcis-transisomerase，PPI)。以PDI为例，众所周知，蛋白质分子中的二硫键与新生肽段的折叠密切相关，对维系蛋白质分子的结构稳定性和功能发挥也有重要作用。PDI定位在内质网管腔内，含量丰富，催化蛋白质分子内巯基与二硫键之间的交换反应。同时，它是目前发现的最为突出的多功能蛋白，除了二硫键的异构酶的基本功能外，它还是脯氨酸-4-羟化酶的α亚基;又是微粒体内甘油三酯转移蛋白复合物的小亚基，还是一种糖基化位点结合蛋白(gkycisylationsitebindingprotein)等。其中，最引人注目的还是它有与多肽结合的能力，可以结合具有不同序列，长度和电荷分布的肽，特异性较低，主要是与肽的主链相作用，但对巯基尚有一些偏爱。按照分子伴侣的定义，一般认为PDI和分子伴侣是两类不同的帮助蛋白，但是我国上海生物物理研究所最近提出不同的看法，认为蛋白质二硫键异构酶也具有分子伴侣的功能。 蛋白质分子中天然二硫键的形成要求这些在肽链上往往处于不相邻位置的巯基，首先通过肽链一定程度的折叠，才能相互接近到可以正确形成二硫键的位置。肽链的自身折叠是一个慢过程，而蛋白质二硫键异构酶催化蛋白质天然二硫键的形成却是一个快过程。另一方面，蛋白质二硫键异构酶具有低特异性的与各种不同肽链相结合的能力，在内质网中以极高的浓度存在，又是是一个钙结合蛋白，是一个能被磷酸化的蛋白，这些都已经符合了分子伴侣的条件。因此他们推测蛋白质二硫键异构酶很可能首先通过它与伸展的，或部分折叠的肽段的结合，阻止错误的折叠途径，促进正确的中间物生成，帮助肽链折叠是相应的巯基配对，从而是正确的二硫键得以形成;然后催化巯基的氧化或二硫键的异构而形成天然二硫键。他们认为蛋白质二硫键异构酶的酶活性与它的分子伴侣功能不是相互排斥，而是密切相关，协调统一的。分子伴侣与帮助新生肽链折叠的酶之间，大概不应该，也不能够划一条绝对的分界线。我想:酶的最主要特性就是催化生化反应，分子伴侣的主要作用是与新生肽段的错误构象结合，从而阻止肽链不正确的非功能的折叠途径，促使其向正确的折叠方向反应，这难道不可以理解成间接的催化肽链的折叠吗?从表观上看，抑制不正确的折叠途径等于加快了正确反应的速度。所以，我本人也很赞成他们的观点。最近的试验已经为这一假说提供了很好的证据。PDI明显抑制变性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶在复性股过程中的严重聚合，有效的提高它的复性效率，与典型的分子伴侣GroE系统对甘油醛3-磷酸脱氢酶复性的效应极其相似。 五、分子伴侣的结构 目前唯一解出晶体结构的分子伴侣是的PapD，帮助鞭毛蛋白折叠的分子伴侣。还有HSP70的N端结构域，即ATP结合域也以有晶体结构。用电子显微镜已经清楚的看到了GroEL的十四聚体和GroEL的七聚体的四级结构，象两个圆形中空的面包圈叠在一起，用NMR以及各种溶液构象变化是研究分子伴侣作用机制的有效手段。 六、分子伴侣研究的实际应用 分子伴侣的研究成果必然会大大加深我们对生命现象的认识，同时也一定会增加我们与自然斗争的能力和自身生存的能力。由于分子伴侣在生命活动的各个层次都具有重要作用，它的突变和损伤也必定会引起疾病，因此可以期望运用分子伴侣的知识来治疗所谓的”分子伴侣病”。另一方面，利用对分子伴侣的研究成果从根本上提高基因工程和蛋白工程的成功率，也必将对大幅度提高人类生活水平起重要作用。 [参考书目] 1.李宝健主编，面向21世纪生命科学发展前沿，广东科技出版社，1996年11月第一版：93-104页 2．郝柏林刘寄星主编，理论物理与生命科学，上海科学技术出版社，1997年12月第一版：29-58页 3．中国生物物理代表团，从第十三届国际生物物理大会看生物物理学研究的现状和趋势，生物物理学报，1999年第十五卷第四期：826-827页
熊猫盖盖
背景： 呼吸困难是一种常见的症状，影响了 非卧床环境（patients seen in the ambulatory setting） 中多达25％的患者。 它可能来自许多不同的潜在疾病，有时甚至是威胁生命的疾病的一种表现。 方法： 这篇综述是基于在PubMed中通过选择性搜索检索到的相关文章，以及相关指南。 结果： 呼吸困难一词是指各种各样的主观感知，其中一些会受到患者情绪状态的影响。 急性呼吸困难和慢性呼吸困难之间有区别：按照定义，后者已经存在了 四个多星期 。 病史，体格检查和观察患者的呼吸模式通常会导致正确的诊断，但是在 30％至50％的病例中 ，需要进行更多的诊断研究，包括生物标记物测量和其他辅助检查。 当同时存在多种潜在疾病时，很难确定诊断。 呼吸困难的原因包括心脏和肺部疾病（充血性心力衰竭，急性冠状动脉综合征，肺炎，慢性阻塞性肺疾病）和许多其他状况（贫血，精神障碍）。 结论： 呼吸困难的许多原因使其诊断具有挑战性。 它的快速评估和诊断对于降低死亡率和减轻疾病负担至关重要。 呼吸困难（呼吸急促）是一种常见症状，影响了非卧床环境中多达25％的患者。 它可能是由许多不同的潜在疾病引起的，其中一些疾病可能会急性发作并危及生命（例如，肺栓塞，急性心肌梗塞）。 因此，快速评估和有针对性的诊断研究至关重要。 重叠的临床表现和合并症，例如充血性心力衰竭和慢性阻塞性肺疾病（COPD），会使呼吸困难的诊断评估成为一项临床挑战，因此“呼吸困难”一词涵盖了多种主观经验。 这种症状的存在可用于预测高的死亡率。 这篇综述是根据在PubMed中进行的选择性搜索检索到的相关文章，依据的是欧洲心脏病学会（ESC），德国心脏病学会（DGK）和德国肺病与呼吸内科学会的最新指南，以及有关普通内科教科书中包含的信息。 搜索词包括以下内容：“呼吸困难”； “呼吸困难，流行病学”； “呼吸困难，初级保健，患病率”； “呼吸困难，患病率”； “呼吸困难，指南”； “呼吸困难，病理生理学”； “呼吸困难，原因”； “呼吸困难，全科医生”； “呼吸困难，初级保健”； “呼吸困难，急性冠状动脉综合征”； “ PLATO 试验”； “呼吸困难，副作用”； “ EMS，呼吸困难”； “ ED，呼吸困难。” 在共识性论文（1）中，美国胸科学会将呼吸困难定义为“一种呼吸不适的主观体验，包括不同强度的感觉...。 它来自多种生理，心理，社会和环境因素之间的相互作用，并可能诱发继发的生理和行为反应。” 呼吸困难是总括性主观经验的统称，包括努力呼吸即濒死感或窒息以及对空气的饥饿感。 呼吸困难的 主观性是临床医生面临的主要困难之一 ，其任务是确定诊断并判断潜在疾病及其严重性。 呼吸困难的发病机制仍不完全清楚，目前正在研究中。 当前的解释性假设基于调节环路的概念，该电路由集中传递的传入信息（来自pH，CO2和O2的化学感受器以及肌肉和肺中的机械感受器[实质中的C纤维，在支气管和肺血管中的J纤维]）和与之相应的通气反应（2）。 从强度的简单描述（视觉模拟量表，Borg量表）到多维调查表（例如，多维呼吸困难描述），可以使用各种仪器来评估呼吸困难。 这些工具已经过验证，可用于交流。 还有其他特定于疾病的分类，包括纽约心脏协会（NYHA）对慢性充血性心力衰竭的分类（2，3）。 呼吸困难是普通实践和医院急诊室的常见症状。 据报道，在急诊室就诊的患者中有％存在呼吸困难（4）； 在一般临床诊疗中，有10％的人抱怨在平坦的地面上行走时呼吸困难，而25％的人抱怨剧烈运动（例如爬楼梯）时出现呼吸困难（5）。 对于1-4％的患者，呼吸困难是他们咨询医生的主要原因（6，7）。 在专业实践中，患有慢性呼吸困难的患者占心脏病医生所见者的15％至50％，而占肺病医生所见者的不到60％（2）。紧急医疗救援队看到的患者中有12％有呼吸困难，其中一半需要住院； 那些住院治疗的人的院内死亡率大约为10％（8）。 如表1所示，基础诊断的分布因情况而异。 对患者症状进行更精确的分类有助于鉴别诊断。 有多个要考虑的标准（3）： 1. 病程 * 急性发作 vs 慢性发作（持续四个星期以上）vs 已有症状的急性恶化 * 间歇性 vs 永久性 * 某一次（突然出现） 2. 情境性 * 休息时 * 劳累时 * 伴随的情绪压力 * 体位有关 * 特殊的暴露有关 3. 病因 * 与呼吸系统有关的问题（呼吸，气道，气体交换） * 心血管系统疾病 * 其他原因，例如贫血，甲状腺疾病，身体状况不佳（即肌肉无力） * 精神因素 同时存在多种以上的基础疾病有时会使呼吸困难的诊断和治疗更加困难，尤其是在老年多病患者中。 急性发作的呼吸困难可能是危及生命的疾病的一种表现。警报信号包括意识模糊，明显发绀（作为新发现），说话时呼吸困难以及呼吸费力或呼吸衰竭。应立即评估对生命的潜在威胁。必须对生命体征（心率，血压，血液中的氧饱和度）进行测量，以便及时做出下一步决定，特别是患者是否需要在重症监护室急诊或接受侵入性治疗辅助通气。 呼吸频率是病情敏锐度和严重程度的另一个重要标准 。入院时呼吸频率升高表明预后较差（重症监护病房治疗的可能性更高，死亡率更高）（10、11），并且在急救医学和重症监护的许多评分系统中都是独立的参数（例如， Emergency Severity Index和APACHE II）。 最初的误诊会导致住院时间延长，并伴有更高的死亡率（12）。 大多数突然出现呼吸困难的人都感到自己处于严重危险中。 通常，诸如恐慌，焦虑和沮丧之类的情绪因素还会加重患者的主观痛苦。 有关潜在疾病的更多线索可以来自患者的既往病史（包括诊断，干预和手术）以及除呼吸困难以外的指向特定诊断的症状和体征（表2，e表1）。 e表2列出了急性呼吸困难的可能原因。 心电图可以检测出急性心肌梗塞或心律不齐。 胸部X光平片可显示出肺充血，气胸或肺炎。 称为生物标志物的特定血液检查在急性呼吸困难的鉴别诊断中也起着重要作用。 利钠肽，脑钠肽（BNP）和氨基末端脑利钠肽前体（NT-proBNP）可用于排除临床相关的充血性心力衰竭（13-16）。 在欧洲心脏病学会（ESC）指南中，建议BNP的阈值<100 pg/mL，NT-proBNP的阈值<300 pg/mL，以排除急性充血性心力衰竭（17）。 请注意， 有症状的慢性充血性心力衰竭 患者的阈值明显较低（分别<35 pg/mL和<125 pg/mL）。 据报道，利钠肽对排除充血性心力衰竭的阴性预测价值为94％至98％（17）。 如果临床证据表明急性冠状动脉综合征是呼吸困难的原因，那么连续测定心肌肌钙蛋白（肌钙蛋白I或肌钙蛋白T）会有所帮助。 这可以用来高度肯定地排除急性心肌缺血（18）; 阳性测试结果的阈值（或上升阈值）取决于所使用的特定测试。 重复检测肌钙蛋白对急性心肌缺血的阳性预测值为75％至80％（18）。 D-二聚体是纤维蛋白水解产生的纤维蛋白降解产物；在血栓形成事件后发现它们的浓度更高。它们在肺栓塞的诊断评估中具有 较高的阴性预测价值 ，但由于 D-二聚体浓度升高并没有特异性，因此不能用作筛查试验 。在常规实践中，在测量D-二聚体之前，应首先通过其他方式评估发生急性肺栓塞的可能性，例如，采用风险评分（例如Geneva评分）或更常用的 Wells评分 （e表3）。如果肺栓塞的可能性很低（或在某些情况下为中度），则正常D-二聚体浓度有很高的可能性排除肺栓塞。另一方面，如果Wells评分较高，表明很可能发生肺栓塞， 则诊断评估的下一步是影像学研究 。此外，在当前的肺栓塞诊断和治疗指南中，强调了使用年龄调整后的阈值（对于年龄超过50岁的患者阈值推荐为年龄×10 µg / L）可提高D-二聚体测试的特异性，同时将其灵敏度保持在97％以上（19，20）。 患有急性肺栓塞的患者中的心肌肌钙蛋白和利钠肽也可能升高，导致临床上相关的右心劳损[19]。 肌钙蛋白实际上可以在任何急性肺部疾病中升高。 如果有任何临床相关的右心脏劳损的证据，应通过胸腔超声心动图及时评估患者。 慢性呼吸困难通常是由以下几种原因之一引起的：支气管哮喘，COPD，充血性心力衰竭，间质性肺疾病，肺炎和精神疾病（例如焦虑症，恐慌症，躯体疾病）（3、12）。 eTable 2中给出了进一步的原因。但是，在老年多病患者中，通常很难将呼吸困难归因于单个原因。 同样，这里的临床病史（包括危险因素，暴露和先前的疾病[表2，表1]）通常指向正确的诊断或至少缩小了鉴别诊断的范围。 但是，仅一半到三分之二的情况下，就可以仅仅根据病史做出正确的诊断（21-23）。 伴随听诊（显示，例如，肺部充血或呼吸音缺失或增强的证据），观察患者的呼吸模式通常会为可能的潜在疾病提供更多线索。 快速，浅呼吸 反映出间质性肺疾病的肺顺应性降低，而 深，慢呼吸 是COPD的典型特征（24）。 根据个人情况选择进一步的诊断测试； 一种建议的通用诊断算法已经过临床测试（22）。 一些作者建议分多个步骤进行诊断测试，并在每个步骤中提高特异性，以便每个测试的结果都可以正确选择下一个。 通常，仅凭病史和体格检查就可以怀疑特定的诊断，但是，如果不可能，可以进行少量的基础检查，作为缩小鉴别诊断范围和保持诊断的快速简便的方法。 将进一步测试的需要降到最低（图1）。 肺功能描记法可以通过区分心脏和肺部疾病来帮助确定主要原因。 根据这些初步发现，可以为下一步选择适当类型的辅助诊断测试，例如超声心动图，计算机断层扫描或有创右或左心导管进行血流动力学评估（图1）。 初始测试的选择尤其应取决于根据可能的诊断。 这种选择性测试相对于更全面的测试的优势在于可以避免过多的测试。 显然，它的缺点是潜在的诊断延迟以及呼吸困难多因素患者可能无法得出诊断。 在某些情况下，只有通过多种检查才能弄清呼吸困难的原因。 在一项针对1969年没有已知心脏或肺部疾病的呼吸困难患者的研究中，试图确定哪些参数对确定合适的进一步诊断测试类型有最大帮助（25）。 研究了以下参数： 呼吸困难患者诊断的 唯一独立预测因素 是FEV1， NT-proBNP浓度 以及CT上气肿改变的百分比。 支气管哮喘–原因是气道的慢性炎症导致气道阻塞。患者抱怨经常有气促发作，通常在晚上也有发作。可能存在多种过敏因素。诱发因素可能包括呼吸道刺激，过敏原暴露，运动，天气变化和（呼吸道）感染。听诊发现由于阻塞而引起的呼气性喘息。肺活量测定法显示一秒钟的呼气量（FEV1）和呼气峰值流量（PEF）均降低（26），这两者在发作之间的无症状间隔中可能是正常的。吸入支气管扩张药（β2-激动剂或抗胆碱能药）后，梗阻和症状明显改善。哮喘患者的急性呼吸困难发作称为恶化。典型的临床表现是呼吸急促，喘息和呼气时间延长（27）。 慢性阻塞性肺疾病（COPD）–根据世界卫生组织的定义，当咳嗽连续两年内至少持续三个月时，就存在慢性支气管炎。在COPD中，慢性炎症导致肺实质破坏，从而导致肺过度膨胀和弹性恢复力下降。 COPD通常以下气道的固定阻塞为特征。受影响的患者通常超过40岁，几乎都是吸烟者或过去吸烟者（28-30）。肺功能检查和人体体积描记法可提供进一步的诊断帮助。 Tiffeneau指数（FEV1 / IVC，其中IVC是吸气的肺活量）通常低于，并且残留量可能会由于肺过度膨胀而升高。 一氧化碳扩散异常低表示气肿 。胸部X线平片显示膈肌阴影变平，并且常有肺血管的稀疏。需要住院治疗的病情加重与预后差有关。慢性阻塞性肺病与左心衰竭有共同的危险因素，并且 经常与左心衰竭一起被发现 （28、29）。 许多当前或过去的吸烟者都患有类似于COPD的症状，却没有达到经典的定义。在最近发表的一项研究中表明，这些患者的病情加重，日常活动减少，以及气道改变（气道壁增厚）的解剖学证据与COPD患者一样。他们经常用抗气道阻塞的药物治疗，尽管缺乏这种做法的证据（31）。 肺炎-呼吸困难是肺炎的主要症状，主要表现在65岁以上（约80％）的患者中（29）。 胸痛，发烧和咳嗽是典型的伴随症状。 检查显示呼吸急促，吸气啰音，有时还出现支气管呼吸。 实验室检查（炎症参数；严重情况下动脉血气分析中的低氧血症），胸部X线检查以及某些情况下的胸部CT检查有助于诊断。 CRB-65评分用于评估肺炎的严重程度。 每个出现的项目都会获得一个积分：C代表新发疾病的意识障碍，R代表呼吸频率≥30 / min，B代表收缩压<90 mmHg，舒张压≤60 mmHg，65岁以上≥65。 该分数可以作为住院需求的指南。 得分为0的患者通常可以在医院外接受治疗； 得分为1的低氧血症和合并症应住院治疗； 得分为2分或更高的患者均应入院（32，33）。 间质性肺疾病-患者报告慢性呼吸急促和干咳，并且他们经常吸烟（34）。 检查发现肺底有啰音，有时还会发现杵状指。 肺功能测试显示低肺活量（VC）和总肺活量（TLC），正常的高Tiffeneau指数以及减少的CO扩散。 间质性肺疾病的鉴别诊断是复杂的，并且从一种类型的间质性肺疾病到另一种类型，其预后和治疗也不同。 最好咨询肺科医生（29、35）。 肺栓塞-急性肺栓塞的临床表现通常以急性发作的呼吸困难为特征。 患者常报告胸膜疼痛，有时咯血。 检查发现呼吸浅和心动过速。 通常有证据表明下肢深部静脉血栓形成是肺栓塞的来源（19）。 充血性心力衰竭—伴随呼吸困难，还有其他症状，包括疲劳，运动耐力下降和体液潴留（17）。 常见原因是晚期冠心病，原发性心肌病，高血压和瓣膜性心脏病。 射血分数降低（HFrEF）的心力衰竭即左心室射血分数（LVEF）小于40％的心脏衰竭与心脏充盈压高的保留射血分数（HFpEF）的心力衰竭之间存在着重要的临床区别 （图2）。 还有一种新近描述的实体，称为具有中程射血分数的心力衰竭（HFmrEF，其有舒张功能障碍的征象，并且LVEF在40％至49％之间）（17）。 在所有类型的充血性心力衰竭中，搏出量和心输出量都会减少。 超声心动图是主要的诊断测试。 它可以借助替代参数来评估收缩和/或舒张功能的降低（图2）（36）。 冠心病 —呼吸困难也可能是冠状动脉狭窄的症状，虽然它不是“经典”症状（37）。 它可以与心绞痛同时存在，也可以作为冠心病的主要或唯一症状，例如在糖尿病患者中。 病史，特别是呼吸困难发作的时间和地点（压迫感，寒战等）通常提示冠心病是潜在的原因。 来源不明的呼吸困难患者应评估可能的冠心病。 该评估包括常规的测功学以及与影像学研究相结合的压力测试，例如应力超声心动图，心肌灌注显像和应力磁共振断层扫描。 提示阳性发现后应进行心脏导管检查（37）。 呼吸困难更常见于急性冠状动脉综合征或心肌梗塞以及心源性休克中由于低心排量引起的症状群的一部分（18、39）。 瓣膜性心脏病–特别是在老年患者中，瓣膜性心脏病是呼吸困难的进一步可能原因。 最常见的瓣膜疾病是主动脉瓣狭窄和二尖瓣关闭不全（40）。主动脉瓣狭窄的典型发现包括身体机能下降，晕厥和头晕发作，有时还出现类似于心绞痛的胸痛。 听诊通常指向诊断（在第二肋间间隙胸骨旁听到最大的收缩期心脏杂音，并传导至颈动脉）。 二尖瓣关闭不全的患者表现出心力衰竭的迹象。 由于左心房容量超负荷，心电图常显示出房颤。 在这里，听诊也指向诊断（心脏顶上的全收缩期杂音，有时投射到腋窝中）。 超声心动图是权威的诊断研究。 心脏病和肺部疾病通常同时出现在同一患者中。 如果在这两个器官系统之一中发现呼吸困难的原因，则必须继续在另一个器官系统中寻找可能的其他原因，因为合并症很常见。 世界卫生组织（WHO）将贫血定义为男性的血红蛋白（Hb）值低于 mmoL/L（13 g/dL）或女性低于 mmoL / L（12g/dL）。对于呼吸困难没有明显的Hb阈值。贫血需要在所有情况下进行进一步的诊断评估，尤其是当Hb浓度低于11g/dL或由于不清楚的原因而下降时。 会影响呼吸道的耳鼻喉疾病也会引起呼吸困难。 在上呼吸道障碍中，除呼吸困难以外的主要症状是喘鸣（支气管肺气道受损时为呼气，声门上气道受损时为吸气， 声门处或声门下方为双相呼吸道受损 ）。 一条经验法则指出， 当潮气量减少30％时会出现呼吸困难 （e1）。 可能的原因包括先天性畸形，感染，创伤，瘤形成和神经源性障碍。 可能引起呼吸困难的神经肌肉疾病包括肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良，肌无力，运动神经元疾病，例如肌萎缩性侧索硬化和神经病，例如格林-巴利综合征（e1）。 在大多数情况下，这些疾病除了呼吸困难外，还有其他神经系统表现。 在进行了广泛的体格检查后，诸如焦虑症，恐慌症，躯体化障碍或“功能性疾病”之类的精神疾病应被视为排除诊断。 通过分心或体育锻炼来改善呼吸困难可能是此类干扰的线索。 最后，值得一提的是医源性（药理）呼吸困难的原因。 非选择性β受体阻滞剂 可通过其β2阻滞作用引起支气管痉挛，从而引起呼吸困难发作。 抑制环加氧酶1的非甾体类抗炎药 通过增加脂加氧酶的活性导致花生四烯酸向白三烯的转化增加； 白三烯反过来会引起支气管收缩。 此外，乙酰水杨酸（该类药物的成员）如果以高剂量服用，也会通过中枢受体引起呼吸困难。 尽管最初的PLATO研究（e2）显示它在％的患者中出现，但血小板凝集抑制剂替格瑞洛引起的呼吸困难在常规实践中无疑是罕见的事件。 该作用可能是由 腺苷受体 介导的。
Smileの夏天
WS/T 462—2015 guàn zhuàng dòng mài jí bìng hé xīn lì shuāi jié shí xīn zàng biāo zhì wù jiǎn cè yǔ lín chuáng yìng yòng
Clinical practice of cardiac markers in coronary artery disease and heart failure
ICS
C 50
中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 462—2015《冠状动脉疾病和心力衰竭时心脏标志物检测与临床应用》（Clinical practice of cardiac markers in coronary artery disease and heart failure）由中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会于2015年06月23日发布，自2015年12月31日起实施。
本标准按照GB/T —2009给出的规则起草。
本标准起草单位：复旦大学附属中山医院、北京医院、华中科技大学附属协和医院。本标准主要起草人：潘柏申、杨振华、吴健民、郭玮、王蓓丽。
冠状动脉疾病和心力衰竭时心脏标志物检测与临床应用
本标准规定了心脏标志物检测的临床应用和质量管理要求。
本标准适用于临床实验室以及研制和生产心脏标志物试剂的单位。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
NCCLS EP9 美国临床实验室标准化委员会
EP9文件用患者标本进行方法比对及偏倚评估（national mittee for clinical laboratory standards EP9 method parison and biasa estimation using patient samples）
下列术语和定义适用于本文件。
急性冠状动脉综合征 acute coronary syndrome；ACS
冠状动脉内不稳定的动脉粥样斑块破裂或糜烂引起血栓形成所导致的心脏急性缺血综合征，包括ST段抬高性急性心肌梗死、非ST段抬高性急性心肌梗死及不稳定型心绞痛。
心肌梗死 myocardial infarction；MI
急性、持续性缺血、缺氧（冠状动脉功能不全）所引起的心肌坏死。
心力衰竭 heart failure；HF
心肌收缩功能明显减退，使心排血量降低，伴有左心室舒张末压增高，临床上引起肺淤血和周围循环灌注不足的表现，以及两者不同程度的合并存在。
心肌肌钙蛋白 cardiac troponin；cTn
心脏横纹肌收缩中起主要调节作用的蛋白质。有三个亚基：与原肌球蛋白结合的肌钙蛋白T、调节
肌动球蛋白ATP酶活性的肌钙蛋白I和钙结合的肌钙蛋白C。
B型尿钠肽（B型利钠肽） B natriuretic peptide；BNP
由心肌细胞合成的具有生物学活性的天然激素，主要在心室表达，同时也存在于脑组织中。当左心室功能不全时，由于心肌扩张而快速合成释放入血，有助于调节心脏功能。
B型氨基端尿钠肽原（B型氨基端利钠肽原） Nterminal pronatriuretic peptide；NTproBNP
人心肌细胞首先合成含108个氨基酸的B型钠尿肽原（proBNP），之后在内切酶的作用下被切割为含76个氨基酸的N末端B型钠尿肽原（即NTproBNP）和含32个氨基酸的C端多肽BNP。
肌酸激酶 creatine kinase；CK
可逆地催化ATP及肌酸之间转磷酸反应的酶，是细胞能量代谢的关键酶，根据分布的部位可分为肌肉型（M型）、脑型（B型）和线粒体型（Mt型）肌酸激酶同T酶。
肌酸激酶MB同工酶 creatine kinaseMB；CKMB
肌酸激酶有四种同功酶形式：肌肉型（MM）、脑型（BB）、杂化型（MB）和线粒体型（MiMi）。MB型主要存在于心肌细胞中。
高敏C反应蛋白 high sensitive C reaction protein；hsCRP
CRP是在感染和组织损伤时血浆浓度快速、急剧升高的主要的急性相反应蛋白，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。hsCRP是采用超敏感检测技术检测CRP，能准确的反应低浓度时CRP的水平。
缺血修饰白蛋白 ischemia modified albumins；IMA
在缺血／再灌注发生时，由于白由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白则称缺血修饰白蛋白。
髓过氧化物酶 myeloperoxidase；MPO
一种存在于具吞噬功能的白细胞中的溶酶体酶，通过将过氧化氢和氯离子变为次氯酸参与对外来物质的破坏。
检测周转时间 turnaround time；TAT
从医生申请检验项目到收到检验报告的时间。
判断值 cutoff value
临床上用于判断某种疾病可能性的临界值。
POCT pointofcare testing
不需要固定、专用的场所，在患者近旁进行的、采用可携带式分析仪器并具有操作简便和能快速得到检测结果的检测方式。
适用于临床的心脏标志物应具有较好的诊断、危险分层和预后估计的价值；对临床诊治病人有较好的指导价值；分析检测方法应特异、敏感、快速、便捷，费用合理。
心脏标志物的正确应用有助于明确诊断，避免漏诊、误诊；有助于尽早进行有效治疗，减少并发症；有助于避免其他更昂贵的检查，减少医疗资源的浪费，节省相关费用。心脏标志物检测结果的解释应结合患者病理生理变化，使其成为观察机体变化的重要手段。临床疾病的发展是致病因素和机体的防御一修复机制之间的动态变化过程，标志物只是部分反映了这一变化。心脏标志物的应用并不能替代认真的临床观察、分析和判断。
对疑为急性冠状动脉综合征（ACS）或其他原因引起的心肌损伤病人应进行心肌损伤标志物的检测。
心肌肌钙蛋白（包括cTn I和cTn T）是目前诊断心肌损伤、坏死时特异性最强和灵敏性较高的生物标志物，在ACS的危险分层中也有重要的临床应用价值。
cTn I和cTn T的临床应用价值相同，没有必要同时检测。
在没有条件使用cTn时，可以采用CKMB（建议用CKMB质量法）或总CK的检测方法。
不同的cTn I检测系统的参考区间不同，对同一标本的检测值可能会有明显差异，在比较不同检测系统的检测结果时应特别注意。
心肌损伤标志物检测出现如下结果之一时，应结合临床，考虑有心肌损伤、坏死：
a） 发病后24 h内cTn检测值至少有一次超过参考范围上限值（第99百分位值）；
b） CKMB质量法检测值至少有两次超过特定的参考范围上限值（第99百分位值）；
c） 若没有条件检测cTn或未能使用CKMB质量法时，总CK检测值超过特定的参考范围上限值两倍以上。
发病6h以内的心肌损伤标志物中，肌红蛋白是目前较好的早期标志物。
在临床观察了解MI后有无再梗死或梗死区域有无扩大时，肌红蛋白或CKMB是较好的标志物。 开展cTn检测后，在诊断AMI时应不再应用天冬氨酸氨基转移酶（artateaminotransferase，AST）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD）及β羟丁酸脱氢酶（βHydroxybutyrate Dehydrogenase，HBD）等检测项目。
心电图已有ST段抬高和（或）出现病理性Q波的ACS患者，应立即采取必要的诊治措施，不必再等待心肌损伤标志物的检测结果。
血修饰白蛋白（1MA）检测出早期心肌缺血的临床灵敏度较高，但其临床特异性还需更多的临床研究证实。
过氧化物酶、CD40配体、妊娠相关血浆蛋HA等在评价心肌缺血和ACS危险分层方面显示较好的价值，但其临床特异性还需更多的临床研究证实。
cTn是较理想的危险分层标志物。对所有心电图检查无ST段抬高、临床疑似ACS的患者应进行cTn的测定。如果测定结果超过参考范围上限（第99百分位值）时，应考虑有发生猝死和其他心脏事件的危险。此类患者在就诊时及随后的观察中应进行系列的采血，检测cTn。对大多数患者，如就诊时检测为阴性，则应分别于6 h～9 h和12 h～24 h内再采血检测cTn。
检测BNP或NTproBNP可用于对心电图检查无ST段抬高、临床疑似ACS的患者的危险分层。 高敏感法检测C反应蛋白（hsCRP）也可用于疑似ACS患者的危险分层。临床治疗降低hsCRP能否减少心脏事件发生尚无定论。
检测BNP或NTproBNP是诊断心力衰竭（HF）的重要依据之一。对临床表现为呼吸困难的患者，检测BNP或NTproBNP有助于心源性和非心源性呼吸困难的鉴别诊断。BNP或NTproBNP增高不等于都是心力衰竭；BNP或NTproBNP不高特别有助于排除左心收缩功能不全的诊断。BNP或NTproBNP在舒张期心功能不全中的应用价值有待进一步证实。
BNP或NTproBNP对心脏疾病诊治的临床应用价值相似，没必要同时检测。
有证据表明，在MI后左心收缩功能不全的患者中或有HF危险性（有MI史；糖尿病等）的患者中检测BNP或NTproBNP有助于HF的早期发现或诊断。
在对ACS或HF患者进行危险分层和预后估计时，BNP或NTproBNP可提供有临床价值的信息。
在BNP或NTproBNP的检测参考方法确立之前，检测值的单位应为ng/L，不宜用pmol/mL。
BNP或NTproBNP在预后评价和治疗指导等方面的应用仍需更多的临床实验证据支持。BNP或NTproBNP的生物变异约为100%。在解释治疗后BNP或NTproBNP测定值的变化时应考虑生物变异因素。许多因素（如：肥胖、肾小球滤过功能、甲状腺功能、应用雌性激素等）可影响BNP或NTproBNP的水平，应分别建立上述人群无HF时的参考范围。BNP在体外保存稳定性较差，加入精氨酸蛋白水解酶抑制剂或缓激肽抑制剂可减少降解，延长稳定保存时间。NTproBNP在体外较稳定。
C反应蛋白（CRP）是心血管炎症病变的生物标志物。个体的CRP基础水平和未来心血管病的发病关系密切。CRP水平与一些传统用于评估心血管疾病危险性的指标（如年龄、吸烟、血胆固醇水平、血压、糖尿病等）没有直接关系。CRP可增加血脂检查、代谢综合征和Framingham危险评分的预后价值。
由于健康人体内的CRP水平通常<3 mg/L，因此，筛查应使用高敏感的检测方法（high sensitive CRP，hsCRP），即检测方法应具有能检测到≤ mg/L的CRP的能力。
用于心血管疾病危险性评估时，hsCRP< mg/L。为低危险性； mg/L～ mg/L为中度危险性，> mg/L为高度危险性。如果hsCRP>10 mg/L，表明可能存在其他炎症，应在其他炎症控制以后重新采集标本检测。
检测hsCRP宜进行两次（最好间隔两周），取平均值作为观测的基础。
许多心脏标志物不仅在心肌损伤时出现异常，而且在HF等其他心脏疾病时也出现异常，即某一心脏标志物并不仅仅在某一心脏疾病状态时才有异常变化，而一种心脏疾病状态时常常几种心脏标志物先后都有异常变化，并且分别从不同侧面反映了心脏组织损伤或功能改变的情况。
心脏标志物合理的联合应用有助于早期发现心脏疾病（ACS、HF等）的患者，使病人得到早期诊断和早期治疗；有助于监测病情；有助于估计患者的预后；有利于提高心脏标志物临床应用的灵敏性和特异性。
标本准备应注意以下信息：
a） 不同材料容器的影响（例如：检测BNP的标本容器宜为塑料的而不是玻璃的）；
b） 真空采血管分离胶的影响；
c） 不同抗凝剂的影响；
d）保存时间和保存温度对标本的影响；
e）BNP和NTproBNP的体外稳定性。
检测方法应注意以下信息：
a） 抗体的识别位点；
b） 与其他心脏标志物的交叉反应；
c） 干扰因素（如：嗜异性抗体、类风湿因子、人抗鼠抗体等）；
d） 不同的校准品及其定值方法；
e） 可报告范围；
f） 稀释方式等。
标本采集时间见表1。
表1 疑为ACS病人检测心肌损伤标志物标本采集时间
cTn I不同检测系统之间的测定值可能存在差别，临床应用时应充分注意。
在评价BNP或NTproBNP不同检测方法之间测定值的一致性时，应采用患者的样品进行分析比较。分析比较时应按照NCCLS EP9等相关文件的要求，比对标本应涵盖各种浓度。不同BNP试剂盒在100 ng/L附近检测值的一致性非常重要。在多中心合作进行HF诊断治疗或危险性分类临床试验时，这一点尤为重要。检测hsCRP时应采用可溯源到CRM470的校正品。评价不同检测方法之间测定值的一致性时，应采用患者的样品进行分析比较。分析比较时应按照美国临床和实验室标准化协会（clinical and laboratory standards institute，CLSI）的相关文件要求，检测范围包括各种浓度。
心脏标志物的检测不精密度（CV）要求是在参考区间上限值（对cTn应是第99百分位值）的CV应≤10%。
若cTn测定方法在参考范围上限值（第99百分位值）的CV达不到≤10%的要求，应选用能达到CV≤10%的最低检测值作为临床判断值来诊断有无心肌损伤。
BNP或NTproBNP用于心衰[根据纽约心脏学会（HYHA）分类]分级时，其判断值的CV应达到≤10%。
诊断心肌损伤的cTn I、cTn T、CKMB mass以及肌红蛋白检测结果判断值应采用健康人群的参考区间上限值（第99百分位值）；参考区间可因性别不同而异。
BNP或NTproBNP参考区间上限（第95百分位值或第百分位值）因年龄（每10岁一组）和性别不同而异。hsCRP的参考区间因性别不同而异。在检测标准化实现之前，不同分析系统应分别确立不同的参考区间上限值。不同人群应分别确立不同的参考区间上限值。
在临床使用心脏标志物（cTn I或cTn T; BNP或NTproBNP）时，应按照ROC曲线评价使用价值并建立合适的判断值。
应用与HYHA分级相关的BNP或NTproBNP的判断值可以有助于HF的诊断以及了解HF的严重程度。
心脏标志物急诊检测的TAT应达到<60 min。
中心化检测或POCT的方式都可以采用。在急诊检测TAT不能达到<60 min的要求时，应考虑采用POCT方式，以满足临床对检测速度的要求。POCT的检测操作应遵从生产商的要求。非检验专业的操作人员应接受严格的应用培训。采用POCT检测时，应采用定量分析方法。POCT检测结果与中心化检测方法之间的偏倚应≤20%。采用非定量分析的POCT检测后，标本应再进行定量检测。
开展心脏标志物检测的实验室应注重检测质量。检测时每天应至少检测一次质控标本。
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