转基因发光植物研究论文范文

一）自然选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。这类突变没有人工参与并非是没有原因的，一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配[3]。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。在工业生产上，由于各种条件因素的影响，自然突变是经常发生的，也造成了生产水平的波动，所以技术人员很注意从高生产水平的批次中，分离高生产能力的菌种再用于生产。同时也可利用自发突变而出现的菌种性状的变化，去选育优良的菌株，如在味精发酵被噬菌体污染过程中，所选出的抗噬菌体菌株。自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。（二） 诱变育种微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱变微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最合适的环境下合成有效产物[2]。诱变育种和其他育种方法相比，具有速度快、收益大、方法简单等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，在生产中使用的十分普遍。但是诱变育种缺乏定向性，因此诱变突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。目前，人们用于诱变育种的诱变因素有物理因素和化学因素，前者包括紫外线、激光、X-射线、γ-射线和中子等；后者主要是烷化剂(包括EMS，EI，NEU，NMU，DES，MNNG，NTG等)，天然碱基类似物，亚硝酸和氯化锂等。在物理诱变因素中，紫外线比较有效、适用、安全，其他几种射线都是电离性质的，具有穿透力，使用时有一定的危险性，化学诱变剂的突变率通常要比电离辐射的高，并且十分经济，但这些物质大多是致癌剂，使用时必须十分谨慎[1]。目前，多种诱变剂的诱变效果、作用时间、方法都已基本确定，人们可以有目的、有选择地使用各种诱变剂以达到预期的育种效果。诱变育种也可采用复合诱变，即两种或多种诱变剂的先后使用；同种诱变剂的重复作用；两种或多种诱变剂的同时使用。普遍认为复合诱变具有协同效应，如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用，复合诱变较单一诱变效果好。虽然复合因子较单一因子诱变效果有很大优势，但因为目前大多微生物，尤其是抗生素产生菌的遗传背景不清楚，往往对诱变剂，特别是复合诱变剂的选择使用，带有很大的盲目性[4]。通过诱变处理，在微生物群体中，会出现各种突变型个体，但从产量变异的角度来讲，其中绝大多数都是负变株。要从中把极个别的、产量提高较显著的正变株筛选出来，可能要比沙里淘金还难。因此突变株的分离和筛选是诱变育种的关键，体现了突变不定向性和筛选定向性。为了获得我们所需的突变株，使得突变株的新表型得以表达，淘汰原养型或负变株，必须设计一个良好的筛选培养基和确定合适的培养条件。筛选的步骤主要分初筛和复筛，初筛以量为主，选留较多有生产潜力的菌株，复筛以质为主，对少量潜力大的菌株的代谢产物量进行精确测定[5]。筛选的方法依据目的物不同而异，常用的方法有浓度梯度法、影印平板法、生长谱法、琼脂平板活性圈法、纸片法、夹层培养法、循环筛选法以及与电脑化、智能化的高效筛选技术相结合的现代方法。（三） 杂交育种杂交是指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。杂交育种是利用两个或多个遗传性状差异较大的菌株，通过有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等方式，而导致其菌株间的基因的重组，把亲代的优良性状集中在后代中的一种育种技术。通过杂交育种可以实现不同的遗传性状的菌株间杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，获得新的品种。同时不仅可克服因长期诱变造成的菌株活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应[2、本小节将从有性杂交、准性杂交和原生质体融合三种常见的育种技术来介绍杂交育种。A 有性杂交有性杂交是指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。凡能产生有性孢子的真菌，原则上都能像高等动、植物杂交预育种相似的有性杂交方法来进行育种[5]。一般方法是把来自不同亲本、不同性别的单倍体细胞通过离心等方式使之密集地接触，就有更多的机会出现种种双倍体的有性杂交后代。在这些双倍体杂交子代中，通过筛选，就可以得到优良性状的杂种。B 准性杂交准性杂交是在无性细胞中所有的非减数分裂导致DNA重组的过程，微生物杂交仅转移部分基因，然后形成部分重组子，最终实现染色体交换和基因重组，在原核和真核生物中均有存在。准性杂交的方式主要有结合、转化和转导，其局限性在于等位基因的不亲合性。C 原生质体融合原生质体融合就是把两个不同亲本菌株的细胞壁，分别经酶解作用去除，而得到球状的原生质体，然后将两种不同的原生质体置于高渗溶液中，由聚乙二醇（PEG）助融，促使两者高度密集发生细胞融合，进而导致基因重组，就可由此再生细胞中获得杂交重组菌株[7]。原生质体融合技术具有许多常规杂交方法无法比拟的独到之处[8]:由于去除了细胞壁，原生质体膜易于融合，即使没有接合、转化和转导等遗传系统，也能发生基因组的融合重组；融合没有极性，相互融合的是整个胞质与细胞核，使遗传物质的传递更为完善；重组频率高，易于得到杂种；存在着两株以上亲株同时参与融合并形成融合子的可能[9]；较易打破分类界限，实现种间或更远缘的基因交流[10]；同基因工程方法相比，不必对试验菌株进行详细的遗传学研究，也不需要高精尖的仪器设备和昂贵的材料费用等。由于以上优点，迄今，这项技术不仅在基础研究方面，而且在实际应用上，均取得了引人注目的成绩。随着生物学研究手段的不断创新，该技术的基本实验方法逐步完善.经过多年的实际应用，证明微生物原生质体融合确是一项十分有用的育种技术[11]。通过原生质体融合改良工业微生物菌株的遗传本质是培育高产、优质、抗逆性强的良种的一种行之有效的手段，可以与诱变育种等结合使用，同时还需要不断积累有关基础资料，克服育种盲目性，以期达到工业生产的新需求。原生质体融合育种基本步骤为：标记菌株的筛选和稳定性验证→原生质体制备→等量原生质体加聚乙二醇促进融合→涂布于再生培养基，再生出菌落→选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏→生产性能筛选。（四） 代谢控制育种微生物代谢控制育种是指以生物化学和遗传学为基础，研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节的机制，选择巧妙的技术路线，通过遗传育种技术获得解除或绕过了微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使用有用产物选择性地大量合成积累。代谢控制发酵的关键，取决于微生物代谢调控机制是否被解除，能否打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。代谢控制育种和发酵过程的代谢控制培养是实现这一目标的两的手段，而代谢控制育种则为主要支柱技术。微生物代谢控制育种是集生物化学、微生物学、遗传学、发酵工程、生理学、分子生物学、化学等学科交叉产生的一门工程技术，该技术的广泛应用，导致了氨基酸、核苷酸以及某些次级代谢产物的高产微生物菌株大批的推向生产，大大促进了发酵工业的发展。微生物代谢控制育种主要是通过控制酶的作用来实现的，因为任何代谢途径都是一系列酶促反应构成的。微生物细胞的代谢调节主要有两种类型，一类是酶活性调节，调节的是已有酶分子的活性，是在酶化学水平上发生的；另一类是酶合成的调节，调节的是酶分子的合成量，这是在遗传学水平上发生的[。利用发酵过程的一些限制因素来促进或控制酶产生的速率及其活性，可以控制发酵过程中不同阶段的反应处于平衡状态，同时也可以使微生物对外界环境的变化作出相应的反应。在细胞内这两种方式单独或协调进行选育，获得突变株，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。代谢控制育种的调节体系主要包括诱导、分解阻遏、分解抑制、反馈阻遏、反馈抑制、细胞膜透性调节等。（五） 基因工程育种基因工程育种是在基因水平上，运用人为方法将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一细胞，使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达[13]，与前几种育种技术相比，基因工程育种技术是人们在分子生物学指导下的一种自觉的、能像工程一样可预先设计和控制的育种新技术，它可实现超远缘杂交，因而是最新最有前途的一种育种新技术。这种使DNA分子进行重组，再将受体细胞内无性繁殖的技术又称为分子克隆。通过基因工程改造后的菌株叫“工程菌”。这项技术不仅是生命研究发展的里程碑，也使现代生物技术产业发生了革命性的变化。基因工程育种的一般步骤是：(1)目的基因的获得，一般通过化学合成法、物理化学法(包括密度梯度离心法、单链酶法、分子杂交法)、鸟枪无性繁殖法、酶促合成法(逆转录法)、Norther杂交分析法、cDNA文库筛选法、杂交筛选法、编码序列富集(磁珠捕获)、产物导向法、Nod 连接片段筛选法、外显子捕获法及外显子扩增法、剪接位点筛选法、作图克隆法、杂交细胞克隆法、消减杂交法、相同序列克隆法、差异显示逆转录 PCR 法、显微克隆与微克隆法和插入诱变法等方法获得目的基因；⑵载体的选择，基因工程载体主要是质粒和病毒。载体一般为环状 DNA，其要求有自我复制能力、分子小、拷贝数多、易连接和易筛选等特点；⑶重组子体外构建，主要方法有粘性末端连接法、平端连接法、人工接头连接法和同聚物加尾连接法；⑷重组载体导入受体细胞，其主要途径有转化、转导、显微注射、电穿孔法、快速冷冻法和炭化纤维介导法等⑸重组体筛选和鉴定，以合适的筛选方法选择具有最佳性能的突变重组子，重组体筛选和鉴定主要通过表型法、DNA 鉴定筛选法，选择性载体筛选法、分子杂交选择法、免疫学方法和 mRNA 翻译检测法等方法来实现。