论文黑水虻开题报告

2019年11月25日，上海生科院植物生理生态研究所黄勇平，华中农业大学张吉斌团队等人在Cell Research上在线发表了题为Genomic landscape and genetic manipulation of the black soldier fly Hermetia illucens, a natural waste recycler的研究论文。该研究报告了黑水虻（BSF）的高质量基因组图谱，通过CRISPR/Cas9的基因编辑方法，获得了一种能显著提高BSF取食能力的基因型，为优化BSF基因系的产业化提供了有价值的基因组和技术资源。

黑水虻是双翅目，水虻科昆虫，能将有机物转化成动物可食用的资源，基因组大小，16,770个蛋白编码基因。与其他双翅目昆虫相比，黑水虻基因组在septic adaptation(腐败性环境的适应性)的功能类群中的基因大量扩张，包括immune system factors, olfactory receptors, and cytochrome P450s。中肠转录组表明与消化系统以及抵抗细菌等通路大量富集。BSF幼虫取食代表性的有机物的微生物组表明，Firmicutes bacteria(厚壁菌门细菌)在肠道微生物最多。通过CRISPR/Cas9-based技术得到取食能力增强的基因型。

随着人类人口的大量扩增，产生了越来越多的有机废物，它们的处理办法主要有三种：焚烧，填埋，堆肥。然而这些方法或多或少都会造成环境的二次污染。而黑水虻被认为是在全世界唯一可以用于水产以及家禽的饲料原料的昆虫。它们可以高效的利用有机废物转化成蛋白，脂肪等，降低二氧化碳排放，病原菌及抗生素污染。随着测序技术的不断发展，本文利用基因组，转录组，宏基因组及基因的遗传操作，可用于探索BSF生物学特征的遗传基础。

测序样本为10代自交系昆虫，~300×左右测序深度的Illumina sequencing，包括paired-end libraries of short inserts and mate-pair libraries of long inserts，1102 Mb of assembled scaffolds with a Mb N50 length。BSF由于转座子，重复的非编码DNA，以及大量的重复序列导致其基因组很大。

测序深度及GC含量呈现正态分布，表明组装中污染较少。

the BSF genome fills a gap between the Nematocera(长角亚目), the earliest diverging suborder of Diptera, and more recent flies(短角亚目).

BSF与家蝇和果蝇的 nonsynonymous-to-synonymous substitution (dN/dS) ratios分析得出，发现342个基因dN/dS比例高，这些快速进化的基因主要富集在与核糖体相关的功能模块上，它们参与蛋白质合成通路。它们主要富集在氨基酸代谢以及免疫相关的代谢通路中。h这可能由于BSF长期生活在高蛋白以及病原体富集的环境中。

可以看到BSF与其他双翅目昆虫相比，在解毒酶，嗅觉感受，免疫因子，免疫通路相关的基因出现大量扩张，这与它的环境适应是相关联的。

它们通过对BSF幼虫喂食包括食物废物，家禽粪，牛粪和猪粪，分别在第4，6，8，12天提取中肠进行转录组分析。

通过16S rRNA测序，得到BSF在不同取食及不同时间的肠道微生物种类和丰度，可以看到取食牛粪和猪粪的幼虫肠道中有更多种类的微生物类群。不像中肠转录组的表达谱没有规律性，取食与肠道微生物类群相关性很高。这其中厚壁菌门(Firmicutes)的细菌种类最多，它们能分泌多种蛋白酶和果胶酶参与到消化稻草相关肥料的糖类代谢中 Firmicutes have an important role in digestion of animal manure as these bacteria secrete a variety of proteases and pectinases and are involved in degradation of indigestible carbohydrates in straw-related compost

主要的思路就是能让BSF在幼虫阶段吃的更多，转化有机物的能力增加，在成虫阶段减少其移动的距离，这样可以积累大量的种群数量。 首先昆虫的变态过程是通过一系列激素和神经肽控制的，而促前胸腺激素( Ptth )可以控制蜕皮激素的合成与释放。 Ptth 的敲除可以有效延长幼虫到蛹的时间，two sgRNAs, targeted to the second and fourth exons, to disrupt HiPtth substantially in vivo。the last larval instar increased from 4–5 days in controls to > 85 days in mutant larvae of any mosaic forms of disrupted HiPtth。体型和体重也有明显增加，这可能由于延长其取食时间导致的。 其次，通过与果蝇翅发育基因的同源比对，BSF. Vestigial (Vg)编码对果蝇翅大小和形状的基因。通过对其敲除得到了无翅的成虫个体，并且不影响成虫的发育。

提取单个蛹的DNA用于基因组测序，主要通过构建不同插入片段大小的paired-end和mate-pair文库来构建contig和scaffold。

Kmer分析评估基因组大小，Seqtk trim Adaptors and low-quality 的统计使用jellyfish(21mer)。杂合度和其他基因组特征使用GenomeScope。

重复序列注释

orthomclSoftware用于寻找the final orthologs, inparalogs, and co-orthologs。Multiple alignments of protein sequences for each group were performed using Muscle，Gblocks to identify conserved blocks。 Conserved blocks were finally concatenated to 10 super genes with 255,475 amino acids, which were used to quantify the maximum likelihood phylogeny using RAxML。 Codeml from the PAML package was used to calculate dN/dS ratios under the F3X4 codon frequency. Functional enrichment analyses were performed via an online OMICSHARE cloud platform ( ).

肠道微生物的16S rRNA sequencing.