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A Tuft Cell-Like Signature Is Highly Prevalent in Thymic Squamous Cell Carcinoma and Delineates New Molecular Subsets Among the Major Lung Cancer Histotypes 胸腺鳞状细胞癌中高度流行一种类似于Tuft细胞的特征，并在主要的肺癌组织型中划分出新的分子亚型 发表期刊：J THORAC ONCOL 发表日期：2021 Feb 17 影响因子： DOI:   一、研究背景 胸腺上皮瘤（TETs）包括胸腺瘤和侵袭性较强的胸腺癌（TCs）。胸腺瘤根据新生上皮细胞的组织形态和未成熟T细胞的比例，可分为A型、AB型、B1型、B2型、B3型和其他罕见类型。TCs的分化程度不一，但胸腺鳞状细胞癌（TSQCCs）约占80%的病例。由于它们的罕见性和代表性细胞系的匮乏，现阶段对TETs的生物学认识不足。手术以外的治疗仍然主要是经验性的，有效的长期治疗方案是不可用的。 二、材料与方法   1   数据来源 1）TCGA：胸腺瘤（也包括TC）（N = 117，包括A型(N = 10)、AB型(N = 48)、B1型(N = 12)、B2型(N = 25)、B3型(N = 10)、微结节胸腺瘤(N = 2)和TCs(N = 10)），肺SQCC和肺腺癌。 2）GSE57892：包含22例TETs型A(N = 5)、AB(N = 2)、B2(N = 3)和B3胸腺瘤(N = 5)和TC(N = 7) 3）George等人提供的66例肺LCNECs 4）RT-qPCR：60个速冻的TETs病例 5）免疫组化的分析：该队列包括胸腺瘤、胸腺和非胸腺SQCCs以及神经内分泌肿瘤（NENs）   2   分析流程 1）RT-qPCR、IHC、Western Blotting 2）统计分析：Wilcoxon检验、Student's t检验、chi-square检验、Fisher's exact检验、无监督聚类、富集分析、生存分析 3）胸腺滤泡细胞表达试剂盒：根据最近发表的小鼠胸腺上皮细胞（TEC）亚集（GSE114651）的基因表达标志，16 KIT，人TC标记的小鼠同源物KIT的mRNA表达水平在小鼠胸腺Tuft细胞中高于其他mTEC亚集和皮质TECs。这一发现促使作者调查已发表的人类胸腺瘤和TCs的基因表达数据集，以获得Tuft细胞标记物。 三、结果展示 01 - TCs在mRNA水平上表达胸腺滤泡细胞相关基因 搜索TCGA 数据集的胸腺瘤和TCs的24个基因的mRNA表达水平，这些基因在正常的小鼠胸腺Tuft细胞中特征性地表达，但不在其他正常TEC亚集，作者发现TCs经常表达这些基因。 POU2F3，Tuft细胞的主调节器，和ALOX5，GFI1B，CHAT和L1CAM的表达水平显著高于TCs比A型（CHAT除外），AB和B1-3胸腺瘤（图1）。通常局限于正常皮质TEC和非tuft细胞mTEC亚群15的基因在TC中的表达与胸腺瘤相比没有显著升高（补充图3A）。在Petrini等人提供的独立TET数据集中也观察到TC中Tuft细胞标志物的上调（补充图3B）。最后，在60个速冻TET队列中，RT-qPCR分析证实，两个关键的Tuft细胞标志物POU2F3和GFI1B的表达水平在TCs中显著高于A型、AB型、B1型、B2型和B3型胸腺瘤（图2A）。 02 - TSQCCs普遍表达关键的Tuft细胞蛋白，POU2F3和GFI1B 124例福尔马林固定、石蜡包埋的TET（包括上述速冻病例中的部分（60例中的7例））的IHC显示，虽然阳性细胞的比例不一（图2C），但几乎所有的胸腺瘤和胸腺NENs都是阴性的，但约70%的TSQCC中都有POU2F3蛋白表达（图2B）。同样，GFI1B的表达在TSQCC和其他TET亚型之间有显著差异，但GFI1B阳性TSQCC的比例低于POU2F3阳性TSQCC。POU2F3和GFI1B的IHC也成功标记了胰腺中的正常Tuft细胞。 与TSQCC相反，来自其他器官的SQCCs和NENs通过IHC呈POU2F3阴性。值得关注的是，皮肤SQCCs也是POU2F3阴性，尽管POU2F3在正常角质细胞中表达（图2B）。 03 - Tuft细胞样和非Tuft细胞样的TSQCCs代表不同的子集 作者的TSQCC病例中共有30%，TCGA联盟和Petrini等的队列中也有类似数量的病例表现出非Tuft细胞样表型（图3A和补充图3B）。对所有胸腺瘤和TSQCC的全局基因表达谱进行分层聚类，发现所有的Tuft细胞样TC都聚成一个组，虽然非Tuft细胞样TC分散在胸腺瘤中（图3B）。在驱动基因突变和临床发现方面，两组的规模太小，无法得出有意义的结论（补充图5A和B）。相比之下，TC中最常见的染色体异常--16q的丢失，在所有的Tuft细胞样TC中观察到，但在TCGA和Petrini等的联合队列中的非Tuft细胞样TC中都没有（图3A和补充图5D）。 04 - TC的Tuft细胞样表型与KIT的表达密切相关 比较POU2F3和GFI1B的mRNA表达水平和TSQCCs的经典诊断标记基因、KIT和CD5，在作者和Petrini等的队列中，这两个Tuft生细胞标记物与KIT和CD5的水平有中等至强的相关性，但在TCGA数据集中的相关性较低。此外，在TCGA和Petrini等以及作者的队列中，Tuft细胞标志物和KIT表达的相关性始终很高，且强于Tuft细胞标志物和CD5之间的相关性（补充图5C、5E和6A）。 在蛋白质水平上，从免疫组化队列中随机选择的24个TSQCC中，有12个共表达POU2F3、KIT和CD5，所有POU2F3阳性的病例(N＝17)均表达KIT，尽管12个也是CD5阳性(补充图6B和C)。总之，KIT的表达与TCs的Tuft细胞样表型的相关性比CD5的表达更强。 05 - 一种类似于Tuft细胞的特征和KIT的表达表征了NSCLC的子集 接下来对肺癌的TCGA数据进行分析，寻找簇细胞样mRNA信号。在TET结果的基础上，经验性地定义簇细胞样肿瘤为POU2F3和GFI1B的mRNA表达z得分均大于2（因此称为POU2F3和GFI1B共表达者）。 来自TCGA队列的484个肺SQCCs中，共有9个是POU2F3和GFI1B共表达者，这个子集不仅发现其他Tuft细胞标志物上调，而且还发现KIT上调（图4A和补充图7A）。对全局基因表达谱进行分层聚类发现，9个簇细胞样肺SQCC中的8个聚成一个组，表明它们形成了一个独特的亚型（图4A）。 利用基因本体富集分析，发现与细胞核相关的转录本，尤其是转录因子，在丛生细胞样肺SQCCs中显著富集（图4B），强调它们在转录本水平上与非丛生细胞样肺SQCCs不同。在基因水平上，RB1失活突变在tuft细胞样亚组中显著更常见，尽管TP53突变在两个亚组中同样分布（图4C和补充图7B）。 分析TCGA数据集提供的虚拟组织学切片，簇细胞样肺SQCCs的分化普遍比非簇细胞样病例差，9例中仅有3例表现为局灶性角化（补充图7D）。在临床上，女性和重度吸烟者在tuft细胞样肺SQCCs中的比例过高（图4D）。虽然在TCGA队列中发现簇细胞样肺SQCCs的阶段明显较低，但没有发现显著的生存差异（图4D和补充图7D）。 在510个TCGA肺腺癌中，有3个是Tuft细胞样肿瘤，与它们的SQCC对应物相似，它们表达KIT，聚集在一起(补充图7E)，显示RB1拼接突变或深度缺失以及TP53突变(补充图7F)，并且在组织学上分化较差(补充图7G)。事实上，在对合并的肺SQCCs和腺癌的TCGA数据集进行层次聚类分析时，两个队列的丛细胞样子集聚成一个组，表明它们的肿瘤生物学相似（图4E）。 分析了George等人提供的数据集，根据mRNA表达的绝对值确定了12个POU2F3和GFI1B共表达者和54个非簇细胞样病例（图5A）。前者显著共表达其他簇细胞制造者和KIT，12例中有8例在基因表达分析上聚成一个小群(图5A)。与之前对SCLC的研究一致，19例簇细胞样LCNECs不表达Rudin等提出的其他3个POU2F3阴性SCLC亚组的主转录因子，神经内分泌标志物CHGA和SYP的表达水平明显低于非簇细胞样LCNECs（图5B）。 与簇细胞样肺SQCC和腺癌相似，簇细胞样肺LCNEC常有TP53和RB1突变，且RB1突变频率明显高于非簇细胞样队列。此外，LCNEC整体典型的STK11热点突变，在所有簇细胞样LCNEC中都不存在（图5C）。尽管存在这些分子差异，但两组之间的临床特征并无不同（图5D）。 四、结论 本研究中，作者报告了tuft细胞相关基因，特别是POU2F3和GFI1B，在大多数TSQCCs中高表达。此外，肺鳞状细胞癌(SQCC)、腺癌和大细胞神经内分泌癌(LCNECs)等较小的子集也表达了类似tuft细胞的特征。总之，tuft细胞样表型确定了TSQCCs的一个新的亚组和不同的肺癌类型，具有不同的分子和病理特征。这种特征伴随着独特的临床、组织学和遗传学特征，表明它在各自的癌症类型中划分了生物学上相关的子集。

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张志庸，男，天津市人，cccc毕业生，毕业后在甘肃从事临床工作10年。以后考入中国协和医科大学胸外科研究生，毕业获医学硕士学位，留北京协和医院胸外科任外科医师。1985年至1987年在美国加州Loma Linda 医科大学胸心外科进行Fellowship 训练2年。1991年和1999年分别赴美国加州旧金山分校和日本岗山大学短期学习访问。1994年晋升为北京协和医院胸外科教授、主任医师，并任胸外科主任。近四十年来一直从事外科、胸外科医疗、科研、教学工作，对于胸外科的基础理论、基本概念、基本技能有着深厚的功底，对胸外科各种疾病的诊断、手术治疗和术后处理有较高水平，尤其对胸外伤，肺癌，食管癌，贲门癌和纵隔肿瘤的诊断及治疗，危重症抢救和疑难病症处理，有着丰富的临床经验。学习努力，刻苦钻研，对技术精益求精。数十年来工作在临床第一线，善于从临床实践中总结，不断提高诊治水平。在总结临床经验的基础上，执笔在核心期刊发表了中外文医学论著50余篇，如胸腺类癌，胸腺癌外科治疗长期结果，重症肌无力单纯胸腺切除疗效分析，影响胸腺瘤切除和预后的诸因素分析，肺癌术后早期骨脑转移，支气管类癌，乳糜胸的治疗，胸骨后甲状腺肿外科治疗，纵隔神经源性肿瘤的诊断与治疗，胸内肿瘤所致异位ACTH综合征，北京协和医院外科治疗肺癌生存率编化分析，溃疡病胃大部切除后食管癌的外科治疗，食管穿孔和破裂的诊断和治疗，肺隔离症，肺曲菌球手术治疗，自发性气胸的处理等，对于临床医师有很大帮助。此外还参加了10余部医学专著的编写译工作，如“黄家驷外科学”，“现代呼吸病学”，“现代胃肠病学”，“现代胸心外科学”，“现代胸心外科临床实践”。主编“胸部肿瘤”、“胸外科医师临床效率手册”、“北京协和医院胸外科诊疗常规” 和 “临床实用纵隔外科学”。主译“现代胸外科最新治疗方法”、“肺气肿外科治疗”等医学专著。积极从事科学研究工作，参加重症肌无力、胸腺肿瘤、支气管类癌、异位ACTH肿瘤和食管切除后胸胃功能和胸胃胃电等临床科研工作，其中气管支气管肿瘤外科治疗、经胸全胃切除治疗晚期贲门癌和胸腺切除治疗重症肌无力等科研项目获中国医学科学院和卫生部科技进步奖。善于临床教学，承担协和医科大学的教学任务，每年为协和医大学生授课，带教实习医师和进修医师。教学严谨，要求严格，提倡独立思考理论联系实际。已培养数名研究生，数十名胸外科进修生。

WHO胸腺瘤病理分类法是Rosai领导的专家组于1999年公布的，后于2004年得到修改，是目前应用最广泛的胸腺肿瘤病理分类系统。 根据肿瘤上皮细胞形态将胸腺瘤分为A型、B型、AB型，A型由梭形肿瘤上皮细胞组成，B型由圆形上皮样细胞组成，具有二者混合表现的为AB型。按照淋巴细胞的比例将B型分为B1型、B2型和B3型3个亚型，B1型富含淋巴细胞，有少量上皮细胞；B2型的淋巴细胞与上皮细胞比例接近；B3型以上皮细胞为主，淋巴细胞稀少 。胸腺瘤除了上述分类外，还有几种罕见肿瘤无法归纳至以上标准分类中，包括小结节型胸腺瘤、化生型胸腺瘤、硬化型分类法胸腺瘤等。1999年分类法把胸腺癌定义为C型，2004年删除了胸腺瘤中C型类别，将胸腺癌另列为一类，胸腺癌表现为明显的恶性肿瘤细胞学特征，有多种组织学类型，包括低度和高度恶性肿瘤，低度恶性胸腺癌包括鳞状细胞癌、粘液表皮样癌和基底细胞癌等，高度恶性胸腺癌包括淋巴上皮瘤样癌、小细胞癌、肉瘤样癌、透明细胞癌、未分化肿瘤等。

A型胸腺瘤占5%-24%，患者就诊时年龄大，中位年龄约为61岁，24%合并重症肌无力，绝大多数患者为Ⅰ期。A型和AB型的生物学行为与良性疾病相似，AB型占11%-43%。B型常合并重症肌无力和其它免疫疾病，B1型恶性程度略高于A型、AB型，低于B2型、B3型，是低度恶性肿瘤，占8%-38%。B2型胸腺瘤的恶性程度高于B1型，低于B3型，占4%-46%。B3型以往被定义为分化好的胸腺癌，常无包膜，侵犯纵隔脂肪及邻近器官，预后差，占6%-34%。胸腺癌和其它器官恶性肿瘤相似，复发率高，生存期短，预后最差 [ 2 ] 。A型、AB型、B1型、B2型、B3型肿瘤的侵袭性分别为10%-40%、30%-40%、45%-50%、65%-70%、85%-90%，B1型、B2型、B3型侵袭性高，多为Ⅲ期或Ⅳ期疾病 [ 3 ] 。

1/3胸腺恶性肿瘤患者表现为无症状的前纵隔肿物，多在影像学检查时发现；1/3表现为局部症状，如：咳嗽、呼吸困难、胸痛、咯血、吞咽困难、声音嘶哑、上腔静脉压迫综合征、膈神经麻痹等；还有1/3患者表现为副瘤综合征，最多见的为重症肌无力，约30%-50%胸腺瘤患者伴重症肌无力，而单纯性红细胞再生障碍、低丙种球蛋白血症、红斑狼疮等约占28%。就诊时胸腺瘤患者出现转移并不常见，最常见的转移部位是胸膜，胸腔外转移不到10%，转移部位有肾、淋巴结、肝、脑、肾上腺、甲状腺、骨。与胸腺瘤不同，胸腺癌侵袭性强，就诊时转移常见，转移部位有骨、肺、肝、胸膜和淋巴结，极少伴有副瘤综合征 [ 4 ] 。

近80%胸腺瘤患者在正位胸片上表现为纵隔轮廓异常或肿物 。胸部增强CT是诊断前纵隔肿物的首选影像检查方法，CT不仅能显示病变大小、密度、边缘，而且能提示病变与胸腔内周围器官包括大血管、肺、心包、心脏、胸膜等的关系，肿块内钙化、出血、坏死常提示肿瘤侵袭性高。MRI对评价病变是否侵犯血管更有优势。Sadohara等 [ 5 ] 回顾性分析了胸腺肿瘤的CT与MRI的表现，在CT和MRI影像上，与低危(A型、AB型、B1型)和高危(B2型、B3型)胸腺瘤相比，胸腺癌多表现为不规则轮廓、坏死或囊变、不均匀强化、淋巴结肿大及大血管受侵。MRI影像上，与高危胸腺瘤和胸腺癌相比，包膜完整、分隔、均匀强化在低危胸腺瘤更常见，MRI在显示包膜、分隔或瘤内出血方面优于CT。

尽管探讨正电子发射计算机断层扫描(positron emission tomography, PET)对胸腺肿瘤诊断价值的研究多是小样本的，但多数研究显示 PET能够区分胸腺增生和胸腺瘤，也可区分胸腺瘤和胸腺癌 ，胸腺癌的标准吸收值明显高于胸腺瘤。PET摄取值与WHO分类相关，但不能鉴别侵袭或非侵袭性胸腺瘤，也不能鉴别胸腺瘤和淋巴瘤 [ 6 , 7 ] 。Inoue等 [ 8 ] 对46例胸腺肿瘤进行了PET检查，结果显示，高危肿瘤的早期和延迟SUV值(分别为、)均显著高于低危肿瘤(分别为、)。早期SUV值> 支持高危肿瘤，以SUV值为截断值，诊断的敏感性、特异性和准确性分别为、、，早期SUV值> ，可区分胸腺癌与其它类型胸腺瘤。

前纵隔肿物的常见病因包括胸腺瘤、淋巴瘤、甲状旁腺或甲状腺肿瘤、生殖细胞肿瘤、结缔组织肿瘤及良性肿瘤等。 通过血α甲胎蛋白、β人绒毛膜促性腺激素等标志物可鉴别生殖细胞肿瘤和胸腺瘤 。临床上，多数情况下需要对淋巴瘤和胸腺瘤进行鉴别，但这两种疾病鉴别起来较为困难。一般来说， 胸腺瘤患者年龄更大，合并相关免疫异常提示为胸腺瘤；淋巴瘤患者多表现盗汗、发热、消瘦和不适等症状 ，体检时应仔细检查浅表淋巴结，肿块伴周围淋巴结肿大在淋巴瘤多见，可行淋巴结活检确诊。

当发现前纵隔肿物且怀疑是淋巴瘤或胸腺瘤时，应行活检以明确诊断。创伤最小的是CT引导下细针抽吸活检(fine needle aspiration, FNA)，但这种方法只能提供细胞学标本，难以明确胸腺肿瘤的组织学分型，更不能鉴别胸腺瘤和淋巴瘤，因此，FNA一般不用于胸腺肿瘤的诊断。CT引导下芯针活检是确诊纵隔肿物的首选方法，它能获取足够的组织进行组织学及免疫组化检查，从而做出准确诊断，尤其是可鉴别胸腺瘤和淋巴瘤，也比较安全。如果不能进行芯针活检或未确诊时，可考虑行纵隔切开术或电视辅助胸腔镜手术(video-assisted thoracic surgery, VATS)活检。

Yonemori等 [ 9 ] 回顾性分析了CT引导下经皮穿刺对138例前纵隔肿瘤的结果，评价其对胸腺上皮肿瘤的诊断价值，敏感性和特异性分别为和100%，阳性预测值100%，阴性预测值，总准确率，经皮穿刺和手术在WHO分类方面的诊断总符合率为，结果令人满意。另有几项研究报告经皮穿刺的敏感性在44%-83%之间。

目前采用最广泛的胸腺肿瘤分期方法是Masaoka于1981年制定的Masaoka分期法，后于1994年得到修改。修改后的胸腺瘤Masaoka分期系统的定义是：Ⅰ期：肿瘤局限在胸腺内，肉眼及镜下均无包膜浸润；Ⅱ期：Ⅱa期：镜下有包膜浸润，Ⅱb期：肉眼可见周围脂肪组织浸润，但局限于纵隔胸膜内；Ⅲ期：侵犯周围器官，Ⅲa期不侵犯大血管，Ⅲb期侵犯大血管；Ⅳ期：Ⅳa期：胸膜或心包浸润，Ⅳb期：淋巴或血行转移。Ⅰ期为非侵袭性胸腺瘤，Ⅱ期及以上为侵袭性胸腺瘤。

胸腺瘤最常见的复发部位是胸腔，其次是纵隔。对于复发的胸腺瘤患者，手术仍然是主要的治疗方法。50 % - 75 %的复发疾病患者仍可以手术，其中6 2 % (45%-71%)可行完全切除。复发后行完全切除患者的生存期能够得到延长，5年生存率近72%，不完全切除的患者仅为0-25% [ 11 ] 。对于不能手术的患者，放疗是有效的治疗方法，有研究报告接受放疗患者的5年生存率为80%。复发患者也可行化疗，一项评价培美曲塞治疗复发胸腺瘤或胸腺癌的Ⅱ期研究中，共16例复发胸腺瘤和11例胸腺癌入组，在可评价的23例患者中，2例完全缓解(complete response, CR)，2例PR，均为Ⅳa期胸腺瘤，胸腺瘤患者的中位进展时间是周，胸腺癌患者是周，表明培美曲塞对复发胸腺瘤有一定的疗效 [ 46 ] 。Loehrer等 [ 47 ] 采用奥曲肽治疗奥曲肽扫描阳性的不可切除或晚期胸腺瘤或胸腺癌患者，在可评价的38例患者中，31例曾接受过化疗，结果显示，2例CR，10例PR，2年生存率为76%，6例胸腺癌或类癌患者无PR。另外文献报告紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨对复发恶性胸腺肿瘤也有一定的效果 [ 48 - 50 ] 。

多种因素能够预测胸腺瘤患者的预后。 多项研究证实Masaoka分期是胸腺瘤最重要的预后因素 。完全切除患者的生存期与分期密切相关，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的5年生存率分别为90%-100%、75%-90%、50%-70%、30%-40%，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的10年生存率分别为85%-95%、70%-85%、25%-60%、0-15% [ 3 ] 。完全切除是另一个预后因素，完全切除的Ⅲ期、Ⅳ期患者的复发率较未完全切除的复发率低。WHO分类也是手术切除后患者独立的预后因素，从A型到C型(胸腺癌)，预后越来越差。大样本研究及 meta 分析 [ 51 , 52 ] 均证实，A型、AB型、B1型生存率高于B2型和B3型，有明显差异，A型、AB型、B1型、B2型、B3型的5年生存率分别为100%、93%、89%、82%、71%，A型、AB型、B1型、B2型、B3型的10年生存率约为20%-30% [ 3 ] 。Okumura [ 53 ] 对273例胸腺瘤的研究显示，A型、AB型、B1型、B2型、B3型患者的20年生存率分别为100%、87%、91%、59%、36%。肿瘤大小也是可靠的预后因素，一项对马萨诸塞州总医院179例患者的回顾性分析表明，病灶≥8 cm患者的复发率显著增加(分别为、28%)，这些患者更多为Ⅲ期或Ⅳ期，多为B1型而不是A型或AB型。大血管受侵也是独立的预后不良因素。此外，伴重症肌无力患者的预后优于不伴肌无力的患者，这可能与合并肌无力患者能更早地就诊有关，而且大多数研究显示，合并重症肌无力的大部分患者是Ⅰ期、Ⅱ期。单纯性红细胞再生障碍(5%-10%)可能影响治疗的完成，尤其是对化疗影响较大。早期复发(< 40个月)也是预后不良因素 [ 2 ] 。

尽管胸腺肿瘤发展相对缓慢，但仍是一种具有侵袭性的疾病。 Ⅰ期、Ⅱ期胸腺瘤应行手术切除，部分Ⅱ期患者可从术后放疗获益。多学科综合治疗在Ⅲ期、Ⅳa期胸腺肿瘤中起重要作用 。现有的多种化疗方案中大多数包括顺铂和蒽环类药物。靶向治疗尚无令人满意的疗效。今后应针对胸腺肿瘤开展多中心前瞻性临床研究，探索更有效的治疗方法。