烟草青枯病论文

几丁质酶转基因植物几丁质酶(chitinase)广泛存在于植物和微生物中,它能降解几丁质,该酶一般由单基因编码.几丁质是许多植物病原真菌细胞壁的主要成分,因而利用几丁质酶转基因植物在防治植物真菌病害中有重要意义.几丁质酶对真菌的抑制作用是通过水解菌丝尖端新合成的几丁质而发挥的.正常的植物中几丁质酶的活性很低,但当病原真菌侵染植物时能诱导产生很高的几丁质酶活性.Broglie等将菜豆几丁质酶的cDNA与CMV 35S启动子重组,导入烟草和番茄中,转化株对立枯丝核菌的抗性显著提高植物抗毒素转基因植物植物抗毒素是植物对病原真菌侵染抵抗所产生的有毒性低分子化学物质.不同的植物可产生不同的抗毒素,目前已从不同的植物中鉴定了200多种植物抗毒素,它们大多数是类黄酮与类萜类物质.病原真菌对非寄主植物抗毒素比较敏感,植物抗毒素的合成和积累与植物的抗病性密切相关.采用rt-pcr的方法，用针对马铃薯y病毒属病毒3′-端序列的简并引物和烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, tmv)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus, cmv)外壳蛋白基因的特异引物，对采自山东聊城的一表现严重花叶、黄化、蕨叶及果实畸形的南瓜（cucurbita moschata）样品进行了检测，同时扩增到了小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus, zymv)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus, wmv)、tmv和cmv 4种病毒的基因组片段，说明该样品受到zymv、wmv、tmv和cmv 4种病毒的复合侵染。这4个病毒分离物分别被命名为zymv-lc、wmv-lc、tmv-lc和cmv-lc。序列测定及分析结果表明，它们与其它相应病毒分离物外壳蛋白基因核苷酸序列的同源性分别为、、、，推导的氨基酸序列同源性分别为、、、。根据完整cp基因核苷酸序列构建的系统进化树显示：42个zymv 分离物可划分为6个基因型，zymv-lc与con、cal、flo等11个分离物属于基因型Ⅲ。zymv中国分离物的变异性最大，不同地区的zymv分离物表现出一定的地域相关性。wmv-lc与中国hlj、chn两分离物表现出较近的亲缘关系；30个tmv分离物可分为4个组，其中tmv-lc与中国fujian、017等7个分离物属于Ⅱ组；48个cmv分离物分为3个亚组，cmv-lc属于亚组ib。 关键词： 南瓜；小西葫芦黄花叶病毒；烟草花叶病毒；复合侵染；cp基因；序列分析 发表日期： 2007年03月06日 同行评议： （暂时没有） 综合评价：复合侵染南瓜的4种病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析 来自: 免费论文网 复制酶即特异性依赖于病毒RNA的RNA多聚酶。是病毒基因组编码的自身复制不可缺少的部分，特异地合成病毒的正负链RNA。1990年Golemboski等报道他们将TMVU1株编码的复制酶的一部分基因序列，即54kD蛋白基因转入烟草中得到的工程植株用很高浓度的TMVU1（500μg/mL）及TMV RNA（300μg/mL）接种时，均表现出很高的抗性，比一般转外壳蛋白基因的植物介导的植物抗病性高得多。后来豌豆早枯病毒54kD的蛋白基因和CMVFny RNA2编码的切去活性中心部位GDD（Gly－Asp－Asp）的复制酶部分基因片段转入烟草，均获得了高抗的工程植物。此外在马铃薯病毒X和Y中也报道了同样成功的研究结果。转入的这些基因均为切除了复制酶活性中心部位GDD核苷酸序列，大多数人认为表达的这些不稳定蛋白产物会干扰病毒复制过程中复制酶复合体的形成及其功能的行使，从而使工程植株具有抗病性。复制酶策略很有应用前景。 抗病毒转基因植物植物病毒病害已成为植物病害的最大类群之一,随着基因工程技术的发展,为培育抗病毒的植物品种开辟了新的途径.目前已有多种方法获得抗病毒转基因植物.利用植物自身编码的抗病毒基因培育抗病毒植物.病毒外壳蛋白转基因植物病毒复制酶转基因植物.移动蛋白转基因植物.植物病毒系统侵染宿主包括两个重要的过程,病毒通过胞间连丝在细胞间移动和通过微管束系统在组织器官间的移动.核糖体失活蛋白转基因植物

自己对号哈1、植物抗虫基因工程 在国家＂863＂计划的支持下，中国农业科学院生物技术研究所成功地人工合成和改造了植物抗虫害的Ｂt基因，获得了高抗棉铃虫的转基因棉花品种和品系。此外，中国农业科学院棉花所、南京农业大学和山西省农科院棉花所等单位还以转基因抗虫棉为亲本，育成了一批抗虫能力在80％以上，单产比主栽品种高15％以上的转基因抗虫杂交棉组合。拥有我国自主知识产权的抗虫棉花的育成和大面积推广应用，标志着我国转基因植物研究开始进入产业化发展阶段。 为了有效控制水稻害虫的危害，中国农业科学院生物技术研究所和华中农业大学合作成功地获得了转Ｂt基因杂交水稻，对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟的毒杀效果达到95％。浙江农业大学（现已并入浙江大学）也成功地将Ｂt基因导入水稻早稻品种。目前转Bt基因抗螟虫水稻已进入环境释放阶段。中国科学院遗传所研制成功的转ＣpTI基因抗虫水稻也分别获准在北京、福建和山西进入中间试验和环境释放。此外，中国农业大学研制的转基因抗玉米螟玉米、复旦大学遗传所研制的转基因抗褐习虱水稻、中国科学院微生物研究所和中国林业科学院林研所研制的抗虫转基因杨树也都进入环境释放阶段。 2、抗病基因工程 中国农业科学院生物技术研究所已成功地人工合成和改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，并导入我国马铃薯主栽品种米拉，获得抗病性提高Ｉ∽Ⅲ级的抗青枯病的转基因株系，现已经农业部批准在四川省进行环境释放。目前抗菌肽基因已经供给国内10多家研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等抗细菌病基因工程研究。 白叶枯病也是危害水稻生产的最为严重的病害之一。中国农业科学院生物技术研究所与国外合作研制成功的转Ｘa21基因抗白叶枯病水稻明恢63株系已分别在安徽省和海南省进行环境释放；华中农业大学和中国科学院遗传所研制的转Ｘa21基因抗白叶枯病水稻也分别进入中试阶段。 真菌病也是严重影响农作物生产的一类病害。中国农业科学院生物技术研究所与中国科学院上海植物生理研究所等单位合作，成功地克隆和修饰了植物来源的几丁质酶基因和葡萄糖氧化酶基因，通过花粉管通道法分别将这两个基因导入棉花，获得了抗黄萎病和枯萎病和枯萎的转基因棉花，这些株系在病圃中表现良好，现已进入中试阶段。 在抗病毒的基因工程方面，国内也取得了很好进展。北京大学克隆了烟草花叶病毒ＴＭＶ、黄瓜花叶病毒ＣＭＶ、马铃薯Ｘ病毒等中国株系以及水稻矮缩病毒的外壳蛋白基因，研制成功的抗黄瓜花叶病毒甜椒和番茄都已经分别在云南和福建进入中试或环境释放。中国农业科学院油料研究所研制的转基因抗条纹病毒花生、北京市农林科学院蔬菜研究中心育成的抗芜菁花叶病毒白菜和新疆农科院核技术生物技术所获得的抗黄瓜花叶病毒转基因甜瓜都已分别进入中试。此外，国内一些研究单位还获得了抗环斑病毒（ＰＲＳＶ）的番木瓜，抗黄矮病和黄花叶病毒的小麦等抗病毒病的基因工程植株。

这就是：中文 随着植物抗病基因工程的发展,越来越多的抗病基因被人们所发现。2004年,Taler等从印度野生瓜的霜霉病抗性品种中克隆得到两个具有丝氨酸乙醛酸转氨酶(serineglyoxylate aminotransferase,SGT)活性的甜瓜霜霉病抗性基因At1和At2。Taler等发现At1和At2具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性与植物光呼吸途径相关,不属于任何一类已知R基因,对病原菌的抵抗没有种属专化性,并且它们的抗病作用与H_2O_2相关,基于此种现象,他们提出一种新的抗病机制“酶抗病性”,这是首次报道的通过改变酶的表达量而赋予植物抗病性。据推测At1和At2还可能对霜霉病以外的其它多种植物叶部病害具有抗性作用,是很有研究价值的抗病基因,并且,“酶抗病性”作用机制的提出还需要更多的基因证据和试验支持。据此本论文从光呼吸作用非常强的大豆中克隆At1和At2的同源基因GmSGT,对其进行序列分析、酶活性中心预测、原核表达分析,并将其转入受体植物中进行抗病性鉴定。现将本论文的主要研究结果及创新点总结如下: 1.利用大豆EST序列和5'-Race技术,首次从大豆霜霉病抗性品种中克隆了编码丝氨酸乙醛酸转氨酶的GmGGT1基因序列(已获得国家发明专利1项,专利号:ZL2005100887 ),同时从受SA诱导的大豆霜霉病感病品种黑农10号中克隆得到了两条GmSGT1的同源基因GmSGT2,GmSGT3。序列分析表明,GmSGT1与Taler等报道的甜瓜霜霉病抗病基因At1、At2氨基酸序列同源性达和;同时,GmSGT1与拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryzae sativa L.)、贝母(Fritillariaagrestis)、紫萍(Spirodela polyrrhiza)的丝氨酸乙醛酸转氨酶同源性达。GmSGT1推导蛋白序列分析显示它具有一个5磷酸吡哆醛结合位点GSQKAL和一个强的过氧化物体定位信号SRI,表明该基因可能在植物的过氧化物体中通过光呼吸途径起作用。GmSGT2和GmSGT3与GmSGT1核苷酸序列同源性高达和,推导的氨基酸序列同源性为和。利用生物信息学方法对GmSGT1,GmSGT2,GmSGT3蛋白的酶学活性中心进行了分析,结果显示三个蛋白序列均具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。 2.首次通过存大肠杆菌中模拟植物光呼吸途径的技术,证实了GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。光呼吸途径中发生的反应:乙醇酸(?)H_2O_2+乙醛酸;乙醛酸(?)甘氦酸。因大肠杆菌中含有乙醇酸氧化酶(GOX),所以向原核表达菌株中加入乙醇酸,可完成上述反应,通过检测H_2O_2量的变化,可确定GmSGT1基因的丝氨酸乙醛酸转氨酶功能。本研究结果显示,只有表达GmSGT1蛋白的组分能诱导大量H_2O_2产生,对照组分无,因此,可以确定GmSGT1具有丝氨酸乙醛酸转氨酶活性。 3.分析了GmSGT蛋白与大豆不同品种的抗性相关性。Western杂交结果显示,抗霜霉病品种早丰5号和九农9号中可检测到有目的蛋白的表达,而感病品种黑农10号中无表达。SA诱导前、后半定量RT-PCR结果表明,感病品种黑农10号在SA诱导前未检测到表达,而SA诱导后有微量表达,大豆对霜酶病的抗病性也有大幅度提高。因此,我们推断,GmSGH的表达确实和SA诱导途径相关,并且随着GmSGT1表达水平的提高,大豆对霜霉病的抗病性也明显提高。 4.构建了GmSGT1植物表达载体,进行烟草转化,获得了转基因植株,并对其进行烟草赤星病,黑胫病,青枯病的抗性鉴定,结果表明转基因烟草显著提高了烟草对赤星病,黑胫病,青枯病的抗性。本研究为Taler等提出的植物“酶抗性基因”提供了新的实验证据。 5.利用抗病品种早丰5号探索了GmSGT1基因在大豆中的时空表达特性,该基因在大豆叶片中有表达,而根,茎中无表达,并且随着生育期的增强而表达增强,生殖生长期最强,然后随着细胞的老化而表达减弱,直至消失。这表明GmSGT1的变化趋势与植物光呼吸的变化趋势相符。同时检测了光呼吸途径中在丝氨酸乙醛酸转氨酶上游起作用的乙醇酸氧化酶(GOX)的表达特性,结果表明GOX的表达水平与GmSGT1表达水平的变化具有一致性,说明GmSGT1表达水平提高的同时,它的上游反应也增强,H_2O_2表达也提高。这与我们推测的GmSGT蛋白在植物光呼吸途径中起作用的结论相符。 6.研究确定了大豆遗传转化体系。建立了大豆早丰5号,黑农10号的胚芽尖组培体系,并利用农杆菌LBA4404介导法将构件好的植物表达载体转化早丰5号,RNAi植物表达载体转化黑农10号,获得了再生植株。同时,对早丰5号的胚芽尖,子叶节,胚轴三种外植体在再生频率,再生时间,K筛选浓度,农杆菌不同侵染时间对重生芽再生频率的影响进行了研究,为早丰5号组培,转化体系的进一步优化提供了实验依据。英文With the development of plant disease resistance genes, more and more resistance genes are found in people. In 2004, Taler and other wild melon from India, downy mildew resistant varieties have cloned two serine glyoxylate aminotransferase (serineglyoxylate aminotransferase, SGT) activity Melon downy mildew resistance genes At1 and At2. Taler At1 and At2 is found with serine glyoxylate aminotransferase activity and plant photorespiration pathway, does not belong to any class of known R genes, resistance to the pathogen resistance without special species, and their role in disease resistance associated with H_2O_2 Based on this phenomenon, they proposed a new resistance mechanism "enzyme resistance", this is the first reported expression of the enzyme by changing the plant disease resistance is speculated that At1 and At2 may also downy mildew than many other leaf diseases of plants resistant to the effect that the great research value of the resistance genes, and the "resistance enzyme" mechanism of the proposed need for more many genes to support evidence and testing. Pursuant to which the paper is very strong from the soybean photorespiration clone At1 and At2 in the homologous gene GmSGT, its sequence analysis, enzyme active site predicted prokaryotic expression analysis, and transferred to the receptor for disease resistance in plants the paper's major findings and innovation are summarized as follows: 1. Using soybean EST sequences, and 5'-Race technology for the first time from downy mildew resistant varieties of soybean clone encoding serine glyoxylate aminotransferase gene sequences GmGGT1 (has received a national invention patent, patent number: ZL2005100887 ),Induced by SA from both downy mildew susceptible varieties of soybean, 10 black farmers have been two GmSGT1 cloned the homologous gene GmSGT2, GmSGT3. Sequence analysis revealed that, GmSGT1 and Taler other melon downy mildew resistance genes reported At1, At2 amino acid sequence homology of up to and ; the same time, GmSGT1 and Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.), rice (Oryzae sativa L.), Fritillaria (Fritillariaagrestis), Spirodela (Spirodela polyrrhiza) serine glyoxylate aminotransferase homology deduced protein sequence analysis revealed that it has a 5-pyridoxal phosphate binding sites GSQKAL and a strong peroxisome targeting signal SRI, showed that the gene may be in the plant peroxisome photorespiration way to work through. GmSGT2 and GmSGT3 and GmSGT1 nucleotide sequence homology as high as and , the deduced amino acid sequence homology was and . By bioinformatics method GmSGT1, GmSGT2, GmSGT3 protein enzyme active sites were analyzed, the results show that the three protein sequences all have serine glyoxylate aminotransferase . For the first time through the simulation of plant survival in E. coli pathway of light breathing techniques, confirmed the GmSGT1 with serine glyoxylate aminotransferase activity. Photorespiratory pathway reaction occurs: glycolic acid (?) H_2O_2 + glyoxylic acid; glyoxylate (?) Gan helium acid. Because E. coli contains glycolic acid oxidase (GOX), so the original strain by adding acid expression, to be completed by the above-mentioned reaction, by detecting changes in the amount H_2O_2 can determine GmSGT1 serine glyoxylate aminotransferase gene function. The results showed that only the expression of GmSGT1 protein component can induce a large number of H_2O_2 production, control components not, therefore, can determine GmSGT1 glyoxylate aminotransferase activity with . Analysis of the GmSGT protein soybean varieties with resistance to relevance. Western blotting results showed that downy mildew resistant cultivars EARLY 5 and 9 farmers could be detected in 9 purposeful expression, while black farmers on the 10th susceptible and no expression. SA induction before and after the semi-quantitative RT-PCR results showed that the susceptible black farmers on the 10th in SA was not detected before the induction of expression, while SA induced the expression of a trace of soybean on the cream of the resistance enzymes have greatly improved . Therefore, we conclude, GmSGH SA induced the expression of true and relevant way, and with the expression level of GmSGT1 increased soybean downy mildew resistance was also improved . Constructed GmSGT1 plant expression vector for tobacco transformation, we obtained the transgenic plants, and gain tobacco brown spot, black shank, bacterial wilt resistance identification, the results showed that the transgenic tobacco significantly increased the tobacco brown spot, black shank, bacterial wilt resistance. Taler, etc. This study proposed plant "enzyme resistance genes," provides a new experimental evidence. 5. Use of resistant varieties as early as 5 to explore the GmSGT1 Feng gene expression in the temporal and spatial characteristics of soybean, the gene expression in soybean leaves in, but the roots, stems and no expression, and increased with the growth period while the expression, most reproductive stage, and then with the decreased expression of cell aging, until the shows that the trend of plant GmSGT1 Photorespiration trend line. Simultaneous detection of the photorespiratory pathway of serine glyoxylate aminotransferase in the upper reaches of the role of glycolate oxidase (GOX) of the expression characteristics, the results show that the expression level of GOX GmSGT1 consistent changes in expression levels, indicating enhanced expression GmSGT1 At the same time, it also increased the upstream response, H_2O_2 expression also increased. We speculate that the GmSGT This plant photorespiratory pathway proteins play a role in the . Study identified the genetic transformation system. HSBC was established as early as 5, soybean, black farmers on the 10th of the embryonic tip tissue culture system, using Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediated plant expression vector will be a good member conversion EARLY 5, RNAi plant expression vector transformed black farmers on the 10th, won the regeneration. Meanwhile, HSBC on the 5th of the embryo as early as sharp, cotyledonary node, hypocotyl explants of three in the regeneration frequency, regeneration time, K screening concentration, Agrobacterium infection time on the regeneration of different frequencies of shoot regeneration was studied for EARLY 5 tissue culture, transformation system provides an experimental basis for further optimization.