中国疼痛医学杂志创刊时间

脊神经结扎神经病理痛模型大鼠脊髓

星形胶质细胞激活与痛行为的关系

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赵 红 姜玉秋 孙 钱 孙艳妮 刘风雨 石玉顺 万 有△

(北京大学神经科学研究所、神经生物学系,教育部神经科学重点实验室,北京100083)

摘要 目的:研究L5脊神经结扎模型大鼠脊髓星形胶质细胞的激活与痛行为之间的关系。方法:

44只雄性SD大鼠180～220 g,随机分成4组,分别为假手术组、脊神经结扎1天、3天和7天组。

行为学上使用von Frey Hair测定大鼠在上述各时间点50%缩足阈的变化( n = 8) ,星形胶质细胞的

激活使用免疫组织化学方法观察其特异性标志物GFAP的染色情况( n = 3) 。结果: (1)脊神经结

扎后1天动物出现机械性痛超敏, 3天和7天痛行为稳定并持续存在;假手术组未见显著变化。

(2)结扎侧脊髓背角星形胶质细胞在术后1天发生激活, 3天和7天可见星形胶质细胞强烈的激活

反应,假手术组亦可见轻微的激活。(3)脊神经结扎后,星形胶质细胞发生了激活,其激活程度和

痛行为的产生和维持紧密相关。结论:脊髓背角星形胶质细胞的激活可能在神经病理痛中发挥作

用。

关键词 星形胶质细胞;胶质原酸性蛋白;神经病理痛;脊神经结扎

THE RELATIONSHIP BETWEEN THE SP INAL ASTROCYTIC ACTIVATION AND NEURO2

PATHIC PA IN BEHAVIOR FOLLOW ING SPINAL NERVE L IGATION

ZHAO Hong, J IANG Yu2Qiu, SUN Qian, SUN Yan2Ni, L IU Feng2Yu, SH I Yu2Shun, WAN You

(Neuroscience Research Institute and Department ofNeurobiology, PekingUniversity, Key Lab forNeu2

roscience, theMinistry of Education, Beijing 100083)

Abstract Objective: To investigate the relationship between the sp inal astrocytic activation and neuro2

pathic pain behavior in L5 sp inal nerve ligation ( SNL) rats. Methods: 44 male SD rats were randomly

divided into 4 group s: sham, SNL 1 d, SNL 3 d and SNL 7 d group s. Animalmechanical allodynia was

rep resented by 50% paw withdrawal threshold (50% PWT) thatwas assessed with von Frey filaments ( n

= 8). Using immunohistochemistry technique, GFAP was examined to evaluate the activation of astro2

cytes ( n = 3). Results: (1) The mechanical allodynia of the left hind paw appeared on day 1 after SNL,

and continuously existed from day 3 to day 7. No significant change ofmechanical allodynia was observed

in sham group. (2) In the ip silateral ( lesion side) lumbar dorsal horn, GFAP immunoreactivitywas ob2

served at day 1. This kind of astrocytic activation maintained intense at day 3 and 7, but a slight degree

of astrocytic activation was observed in sham group. (3) Astrocytes were activated in the sp inal cord in

SNL rats, the degree of astrocytic activation correlated wellwith the development and maintenance of neu2

ropathic pain. Conclusion: Astrocytic activation in the sp inal dorsal horn might p lay a role in neuropathic

pain.

Key words Astrocyte; Glial fibrillary acidic p rotein (GFAP) ; Neuropathic pain; Sp inal nerve ligation

( SNL)

3 国家自然科学基金(30330230, 30570566)和北京市自然科学基金(7052039)资助

△通讯作者

中国疼痛医学杂志Chinese Journal of PainMedicine 2007, 13, (1) ·39·

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神经病理痛( neuropathic pain)是指中枢或者外

周神经系统损伤或疾病引起的疼痛综合征,以自发

性疼痛( spontaneous pain) 、痛觉过敏( hyperalgesia)

和痛超敏( allodynia)为特征。近年来,胶质细胞的

激活成为疼痛研究领域的新亮点[ 1 ] 。本实验以L5

脊神经结扎( sp inal nerve ligation, SNL)大鼠作为神

经病理痛模型,通过测定SNL大鼠机械性痛敏的变

化和脊髓背角星形胶质细胞的激活情况,进一步探

讨神经病理痛大鼠星形胶质细胞的激活和动物痛行

为之间的关系。

材料与方法

1. 动物的分组和模型制备

雄性SD大鼠由北京大学医学部实验动物中心

提供,体重150～180 g。随机分为4组,分别是假手

术组、SNL 1 天、SNL 3 天和SNL 7 天组。每组11

只,其中8只用于行为学检测, 3只用于免疫组织化

学分析。

按照Kim 和Chung[ 2 ]方法制作SNL 模型。大

鼠经水合氯醛(300 mg/kg, i. p. )麻醉后,置于腹卧

位,背部切开皮肤,钝性分离左侧椎旁肌肉,暴露L5

脊神经,并用6号丝线紧紧结扎,止血、缝合并注射

青霉素预防感染。假手术大鼠操作与手术大鼠相

同,但不结扎神经。

2. 动物机械性痛敏的测定

按Chap lan等[ 3 ]报道的“up and down”方法,用

von Frey纤维( Stoelting公司,美国)测定大鼠后足

50%的缩足阈。15 g为本法可测定的最大50%缩

足阈值, 0. 25 g为本法测定的最小50%缩足阈值。

当50%缩足阈值小于4 g时认为出现痛敏。术前和

术后1天、3天和7天测定假手术组和手术组50%

缩足阈值。

3. 免疫组织化学实验

术后1天、3天和7天,动物10%水合氯醛(300

mg/kg, i. p. )麻醉后,打开胸腔,行左心室灌流。取

腰膨大段于恒冷切片机中做连续切片,切片厚度14

μm。

脊髓切片经水化、灭活内源性过氧化氢酶、封

闭,加入GFAP 多克隆抗体(Dako公司) 1 : 750,

4℃过夜后,依次加入生物素标记的二抗( SP29001,

中山) 、辣根过氧化物酶标记链酶卵白素( SP29001,

中山) ,之后3, 3’2联苯二胺(DAB)显色,梯度酒精脱

水,二甲苯透明,封片后显微镜下照相。

4. 统计学处理

行为学采用上述公式计算的动物足底50%的

缩足阈值,免疫组化采用Metamorph软件对结扎侧

脊髓背角浅层进行平均灰度分析,每个脊髓标本选

取5张切片,求其灰度的平均值。数据统计分析采

用Prism 4. 0软件进行,其结果用平均值±标准误

(mean ±s. e. m) 表示。多组数据间差异用单因素

方差分析(one way ANOVA)并继之以Dunnett’s post2

hoc检验,以P < 0. 05作为检验水准。

结果

1. 脊神经结扎后大鼠左侧足底50%缩足阈下

降

脊神经结扎后1天,大鼠结扎侧足底50%缩足

阈较术前基础值有明显的下降,即动物出现机械性

痛超敏, 3天和7天,该痛行为稳定并持续存在(与

手术前正常动物比较, P < 0. 01) 。假手术组动物足

底50%缩足阈较术前基础值未有显著变化(与手术

前正常动物比较, P > 0. 05,见图1) 。

图1 大鼠脊神经结扎后机械性痛敏的变化。术后7天内假手术大

鼠和SNL模型大鼠结扎侧足底50%缩足阈值的变化。

3 3

: P < 0. 01,与术前正常对照组相比

Fig. 1  Tactile allodynia in rats after SNL. The change of 50% paw

withdrawal threshold (50% PWT) in sham and SNL rats within 7 days.

3 3

: P < 0. 01, compared to the p re2operation control

2. 免疫组织化学方法显示脊髓背角GFAP染色

加深,胶质细胞激活

采用免疫组织化学(DAB显色)的方法,观察假

手术( sham)以及脊神经结扎后1 d ( SNL 1d) , 3 d

( SNL 3d)和7 d ( SNL 7d)各时间点星形胶质细胞

的反应(见图2A和2B) 。从图中可以看出, SNL 1 d

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结扎侧脊髓背角GFAP染色较假手术组增强, SNL 3

d和SNL 7 d GFAP染色较假手术组有明显的增强,

即提示神经损伤后1 d星形胶质细胞发生了激活, 3

d和7 d星形胶质细胞发生了强烈的反应;未结扎侧

的星形胶质细胞未发生此种改变。假手术组亦可见

结扎侧脊髓背角星形胶质细胞的轻微激活。

我们对结扎侧脊髓背角浅层进行了平均灰度值

分析,用此值代表星形胶质细胞的激活程度(见图

2C) 。脊神经结扎后1天,星形胶质细胞发生了激

活, 3 天和7 天,星形胶质细胞的激活程度逐渐增

加。

图2 免疫组化染色显示脊神经结扎后不同时间点脊髓背角GFAP染色变化。(A)脊神经结扎后1 d、3 d和7 d脊髓GFAP免疫组织化学染

色。Scale bar = 100μm。(B)为(A)图结扎侧脊髓背角的放大图。Scale bar = 50μm。(C)为(A)图结扎侧脊髓背角浅层平均灰度值的定量

分析。

3 3

: P < 0. 01, 与假手术组相比

Fig. 2 GFAP immunoreactivity in the sp inal dorsal horn after sp inal nerve ligation. (A) Immunostaining of GFAP in the sp inal dorsal horn at days 1, 3

and 7 after SNL. Scale bar = 100μm. (B) Two2fold highermaginification in (A) . Scale bar = 50μm. (C) Quantification of average intensity in the

superficial layers of the ip silateral sp inal dorsal horn as shown in (A) .

3 3

: P < 0. 01, compared with the sham group

讨论

1. 星形胶质细胞的激活反应与神经病理痛行为

的关系

中枢神经系统中的星形胶质细胞执行着多种功

能,如参与构成血脑屏障,调节细胞外离子和神经递

质的浓度,维持细胞外pH值的稳定等。许多刺激

可以激活星形胶质细胞,如神经损伤、炎症、神经系

统感染以及各种致痛因子等。星形胶质细胞激活后

发生一系列的改变,如增生、肥大、GFAP合成增多

和前炎性因子释放增多等。1994年, Garrison等[ 4 ]

通过免疫组织化学技术发现在坐骨神经压迫模型中

星形胶质细胞是激活的,如果用药物MK2 801阻断

异常的疼痛传导也可以阻断胶质细胞的激活,胶质

细胞的激活和放大性疼痛之间有很强的相关性,这

样就将胶质细胞和疼痛联系起来。后来随着研究的

不断深入,人们逐渐发现胶质细胞在许多痛模型中

是激活的[ 5～7 ] 。在本次实验中,我们对脊神经结扎

后不同时间点星形胶质细胞的反应做了一系列观

察,发现星形胶质细胞在脊神经结扎后的1天发生

了激活, 3天和7天,星形胶质细胞发生了强烈的激

活反应。星形胶质细胞的激活主要发生在结扎侧的

脊髓背角,未结扎侧和脊髓腹角未见星形胶质细胞

的激活。这和文献已有的报道相一致,神经损伤后,

星形胶质细胞在神经投射的区域发生了激活[ 8, 9 ] 。

脊髓是传递从外周到大脑疼痛信息的中继站,传递

疼痛的初级传入神经元轴突末梢终止于脊髓背角的

不同层面,在此与不同类型的脊髓次级神经元发生

联系。其中中等直径有髓鞘Aδ纤维和小直径无髓

鞘C纤维终止于脊髓背角浅层[ 10 ] ,这两种纤维介导

伤害性信息的传递。因此,脊髓背角浅层被认为是

和疼痛传导相关的部位。星形胶质细胞在此处发生

中国疼痛医学杂志Chinese Journal of PainMedicine 2007, 13, (1) ·41·

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激活提示这类细胞可能参与了伤害性信息的传导。

脊神经结扎后1天动物即出现明显的机械性痛

敏, 3天和7天动物维持在高水平的痛敏状态。假

手术组未见明显的行为学变化。星形胶质细胞的激

活也发生在脊神经结扎后的1天, 3天和7天,激活

的程度呈上升的趋势。脊髓中的胶质细胞包括星形

胶质细胞和小胶质细胞。根据已有文献报道[ 11 ] ,脊

神经结扎后小胶质细胞不激活或者轻微激活,小胶

质细胞的抑制剂不能反转已经建立的痛行为;而星

形胶质细胞在脊神经结扎后发生强烈的激活反应,

并且与痛行为的发生和维持相平行,提示星形胶质

细胞可能参与了痛行为的形成。小胶质细胞和星形

胶质细胞在疼痛中发挥的作用不同,目前的观点认

为小胶质细胞的激活启动了星形胶质细胞的激活,

而星形胶质细胞的激活程度与放大性疼痛的产生和

维持相关[ 12 ] 。星形胶质细胞与痛行为的产生和维

持的整个过程相关还是只是短暂性相关,星形胶质

细胞的激活是因还是果,单纯的星形胶质细胞的激

活可否诱发痛敏的产生还需实验进一步验证。

2. 星形胶质细胞在神经病理痛中的可能意义

星形胶质细胞和神经元之间关系密切,它们对

神经元周围微环境的改变非常敏感,能迅速发生反

应。发生反应的胶质细胞能释放大量的神经活性物

质和促炎性因子,这些物质能增加初级传入神经末

梢痛递质的释放和增加痛觉传递神经元的兴奋性来

扩大痛觉传递,并和神经元之间形成了一个反馈环

路[ 13 ] 。由此可见胶质细胞不再是中枢神经系统中

的一个静止不动的成分,而是处于一个与神经元不

断进行信息交流的动态过程。胶质细胞通过胶质网

络传递信号,从而与神经元互补,共同参与疼痛的传

导。有关胶质细胞和疼痛关系的深入认识,将为研

制慢性痛的药物提供新的靶点。

截至2012年12月，北医拥有1个国家重点实验室，1个国家工程实验室，29个省部级重点实验室和研究中心。成立了糖尿病研究中心、医学遗传学中心、衰老研究中心、感染病研究中心、系统生物医学研究所、临床研究所、医学信息学中心、中国卫生发展研究中心等研究机构 。国家重点实验室：天然药物及仿生药物国家重点实验室国家工程实验室：口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室教育部重点实验室：分子心血管学教育部重点实验室、神经科学教育部重点实验室、恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室、视觉损伤与修复教育部重点实验室、慢性肾脏病防治教育部重点实验室、辅助生殖教育部重点实验室教育部工程研究中心：再生医学教育部工程研究中心卫生部重点实验室：卫生部精神卫生学重点实验室、卫生部神经科学重点实验室、卫生部肾脏疾病重点实验室、卫生部医学免疫重点实验室、卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室、卫生部生育健康重点实验室卫生部工程研究中心：卫生部口腔医学计算机应用工程技术研究中心北京市重点实验室：皮肤病分子诊断北京市重点实验室、造血干细胞移植治疗血液病研究北京市重点实验室、丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室、脊柱疾病研究北京市重点实验室、生殖内分泌与辅助生殖技术北京市重点实验室、磁共振成像设备与技术北京市重点实验室、恶性肿瘤转化研究北京市重点实验室、食品安全毒理学研究与评价北京市重点实验室、蛋白质修饰与细胞功能北京市重点实验室、儿科遗传性疾病分子诊断与研究北京市重点实验室、肝硬化肝癌外科基础研究北京市重点实验室、骨与软组织肿瘤诊治研究北京市重点实验室、痴呆诊治转化医学研究北京市重点实验室等 2014年度，医学部共获批973/重大科学研究、863计划、科技支撑、卫生公益性行业专项等国家科技计划项目（课题）28项，经费亿元。其中，张强牵头的重大科学研究项目获滚动支持，张强获聘重大科学研究计划项目首席科学家；陆林获聘973计划项目首席科学家。李立明牵头的卫生公益性行业专项获得滚动支持。陶勇获得医学部在863计划领域第一个青年科学家专题项目。2014年度获批国家自然科学基金303项，批准经费亿元。其中，第一医院杨勇、陈旻，口腔医院邓旭亮获国家杰出青年科学基金资助；第三医院王乐今申报的国家重大科研仪器研制项目“植入式青光眼眼压监测与微引流智能仪器的研究”获准立项，批准经费710万元。黄晓军牵头的《移植后白血病复发及移植物抗宿主病新型防治体系建立及应用》、郭卫牵头的《原发恶性骨肿瘤的规范化切除及功能重建的系列研究》两项成果获得2014年度国家科技进步二等奖。2014年度SCI数据库收录的以北京大学医学部为第一作者或通讯作者单位的文章总数为1930篇，北医的科研论文产出数量和质量逐年递增，文章总数较去年的1456篇增长了，在国际著名期刊上发表的高水平文章的影响因子也逐年提高。黄晓军团队在《NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICIN》杂志上发表通讯；乔杰团队在《NATURE》杂志上发表研究论文；纪立农团队在《LANCET》杂志上发表综述；尹玉新团队在《CELL METABOLISM》杂志上发表研究论文。2014年科研合同签约462项，签约资金12405万元。基础医学院王凡教授的技术成果《新型特异性肿瘤显像剂》，以3000万元签约资金，成功转让给广东某药业 。 馆藏资源 北京大学医学图书馆源于1922年7月成立的国立北京医学专门学校图书馆。藏书以生物及医药卫生类为主，截至2010年5月，图书馆共有各类藏书70余万册（含附属医院图书馆）。收藏有中外文纸本期刊近4000种，其中中外文现刊781种。有电子期刊25198种,其中生物医学类电子期刊5000余种。图书馆特藏包括珍、善本古代图书，其中有中国大陆唯一珍善本手抄本《太平圣惠方》一部十函共100卷100册。1985年，国家教育部在医学部建立了全国唯一的医学外国教材中心。1991年，图书馆被卫生部确定为文献资源共享网络系统华北地区中心馆。1993年被卫生部医学情报工作管理委员会确认为科研成果查新定点单位（北京大学医学信息咨询中心）。1998年教育部决定在北京大学医学部设立中国高等教育文献保障系统（CALIS）全国医学文献信息中心，作为“211工程”医药重点学科所需文献的保障基地。2010年5月，被评为BALIS原文传递学科服务馆，成为六家学科服务馆之一 。 学术刊物 期刊杂志名称主办单位创刊时间地位北京大学学报（医学版）北京大学1959年被各检索系统收录情况：国外：美国医学文献分析和联机检索系统、美国EBSCO、美国化学文摘数据库及其《化学文摘》、俄罗斯《文摘杂志》和世界卫生组织《医学增补文摘》收录、世界卫生组织西太平洋地区医学索引、日本科学技术振兴机构文献数据库。国内：中国科技论文与引文数据库、中国科学引文数据库、中国生物医学文献数据库、中文生物医学期刊文献数据库和中文核心期刊要目总览（第5版）核心期刊。也是《中国医学文摘》、《中国生物学文摘》和《中国药学文摘》收录期刊。本刊全文入编万方数字化期刊全文数据库、中国期刊网和中国学术期刊（光盘版）全文数据库。获奖情况：1992年全国优秀科技期刊评比三等奖，1997年第二届全国优秀科技期刊评比二等奖，2004年全国高校优秀科技期刊评比一等奖，首届中国高校精品科技期刊奖，第二届中国高校精品科技期刊奖，第三届中国高校精品科技期刊奖，2003年百种中国杰出学术期刊，2004年百种中国杰出学术期刊，2005年百种中国杰出学术期刊，2006年百种中国杰出学术期刊 。 中国生物化学与分子生物学报中国临床药理学杂志中国药学会1985年全国一级学术刊物、中文核心期刊 。中国药物依赖性杂志中国生育健康杂志北京大学2002年卫生部直属单位专业技术职称评审的核心期刊 。中国药学（英文版）中国药学会1992年为中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）、《化学文摘》、美国《乌利希期刊指南》、英国《国际农业与生物科学研究中心》、波兰《哥白尼索引》、荷兰《文摘与引文数据库》、《中国期刊全文专题数据库》等文摘及数据库收录 。中国微创外科杂志北京大学2001年----------- 中国介入心脏病学杂志北京大学1993年国家级科技核心期刊 。中国血液净化中华医学会医院管理学会国家级重点学术期刊、血液净化专业类核心期刊、中国学术期刊综合评价数 据库统计源期刊、万方数据资源系统全文收录期刊、被“中文 生物医学期刊文献数据库-CMCC”收录 。中国斜视与小儿眼科杂志1993年自1996年起被编入《中国学术期刊光盘版》，1999年进入国家科技部“中国科技论文统计源期刊 。中华医学科研管理杂志中华医学会医学科研管理学会1988年1999年12月，经国务院新闻办、国家新闻出版总署审核备案，本刊由《中国期刊网》、《中国学术期刊（光盘版）》全文收录。同时，作为《中国学术期刊综合评价数据库》来源期刊全文收录 。中国糖尿病杂志北京大学入选2001年“中国期刊方阵”之“双效”期刊 。中华围产医学杂志中华医学会1998年自2000年起被《中国核心期刊（遴选）数据库》、《中国学术期刊（光盘版）》、《中国科学文献引量评价研究中心》全文收录 。中国新生儿科杂志北京大学1986年为“中国科技论文统计源期刊”、“中国科技核心期刊” 。中华医学教育杂志生理科学进展中国生理学会1957年入选《美国医学索引》、《美国化学文摘》、中国科学引文数据库、国家科技部中国科技论文统计源期刊、中文核心期刊要目总览、中国生物医学核心期刊、中国学术期刊（光盘版）、中国期刊网、万方数据资源系统数字化期刊群等 。中国心理卫生杂志中国疼痛医学杂志医院管理论坛