间接免疫荧光检测方法论文

免疫荧光技术是将荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)与相应抗体（或抗原）以化学的方法结合，将荧光标记抗体（或抗原）与标本中相应的抗原结合形成荧光标记的抗体- 抗原复合物，用荧光显微镜观察。在镜下见到有荧光存在即推断有抗原抗体复合物的存在，根据已 知的抗体（或抗原）即可推知另一个未知抗原（或抗体）的存在。1. 直接免疫荧光法直接免疫荧光法是利用荧光色素标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，以鉴定未知抗原。本法具有操作简单、时程短、特异性高的优点，但也 存在缺点如不能检查抗体，敏感性较差。（1）在标本上滴加荧光素标记抗体，放入湿盒中。37℃温育30min。 （2）PBS 冲洗后，再用PBS分三缸浸泡，每缸3min。（3）PBS浸泡1～2min，风干。（4）缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察。进行直接免疫荧光法时应注意：①温育时一定要将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。②用PBS浸泡时应不断振荡。2. 间接免疫荧光法间接免疫荧光法以荧光素标记抗球蛋白抗体，抗体与相应抗原结合后，荧光标记的抗球蛋白抗体与已结合的抗体发生作用，从而推知抗原或抗体的 存在。间接荧光技术可以用已知的抗原检测未知的抗体，也可用已知的抗体测出未知抗原。现以检测流行性出血热病毒抗体（IgM）为例介绍如下：（1）将待测病人血清加至抗原片（流行性出血热病毒感染的Vero-E6细胞片）上，每个稀释 度加2孔，最后2孔加PBS做对照。将玻片放置湿盒中，37℃温育 60min。取出玻片，弃去反应液，用PBS洗涤5min，风干。（2）加入1∶40稀释的FITC标记的羊抗人IgM，37℃温育60min。取出玻片，按步骤2洗涤，风干。（3）PBS甘油封片，荧光显微镜下观察。阳性结果：在细胞膜及细胞质中可见颗粒状荧光颗粒，细胞核 呈红色。注意事项：温育时将玻片放在湿盒中，以防液体蒸发。选择低温、干燥、洁净的环境风干。