葡萄糖含量测定研究分析论文

葡萄糖氧化酶法。1．原理葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，该有色物质在625 nm波长下与葡萄糖浓度成正比。通过侧定蓝色物质的吸光度值可计算样品中葡萄糖的含量。2．仪器①实验室常用设备。②722型分光光度计。3．试剂除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。①三氯乙酸(40％)：称取4．0 g三氯乙酸，用水溶解并稀释至100 mL。②无水乙醇。③2 mol·L-1NaOH溶液：称取8 g NaOH，用水溶解并稀释至100 mL。④1％邻联甲苯胺溶液：称取0．1 g邻联甲苯胺溶解于10 mL无水乙醇中，倒人棕色瓶中，4℃冰箱保存。⑤乙酸缓冲液(pH5．O)：称取14．28 g乙酸钠(CH。COONa．3H20)溶于水中，加入2．7mL冰乙酸，使pH为5．O，用水定容至1L。⑥葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶(Sigma公司)用水溶解，使酶含量为100U／mL。4℃冰箱保存一周。⑦过氧化物酶溶液：0．010 g辣根过氧化物酶溶于10 mL7J(~，4℃冰箱保存一周。⑧酶溶液：取100 mL乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各l mL，混匀。4℃冰箱可保存7周。⑨酶空白液：取100 mI。乙酸缓冲液，分别加人邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各l mL，混匀。4℃冰箱保存1周。(注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶)⑩葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品(纯度大于99％)于80℃干燥至恒量。精确称取O·050 g，用水移人100 mL容量瓶中，定容至刻度线。此标准液相当于浓度为0．5 mg．mI。_。。4．操作步骤①样品处理a．固体样品：称取0．5～5 g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50 mL水后沸水浴15 min。冷却后，转移至100 mL容量瓶中并用水定容至刻度，反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液，如果滤液澄清，可直接用于测定或稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20mL滤液转移至另一容量瓶中，加人无水乙醇至刻度。混合后静置至少30 min，过滤，滤液用于测定。b·液体样品或少糖、淀粉等碳水化合物水解液：吸取2～10 mL样品或水解液，加入4倍量无水乙醇(使乙醇最终浓度为80％，以沉淀不溶性多糖和部分蛋白质)，混合。静置至少30min，过滤后滤液定容备用(如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可于3 000 r／min离心15min，上清液备用)。c．新鲜牛乳等样品：吸取0．5～2 mL样品，用水稀释，加入3 mL 40％三氯乙酸溶液(用于沉淀蛋白质)，用水定容至100 mL，过滤。吸取5 mL滤液，用2 m01．L一，NaOH调节pH至中性，用水定容至i0 mL，备用。②测定a-标准空白管的制备：在试管中加入0．5 mL水和5 mL酶溶液。b·标准管的制备：5支试管中先分别加入葡萄糖标准液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5 mL，再分别加入水0．4、0．3、0．2、0．1．0．0 mL，最后各加入酶溶液5 mL。c·样品空白管的制备：在试管中加人0．5 mI。样品提取液和5 mI。酶空白液。d·样品测定管的制备：在试管中加人0．5 mL样品提取液和5 mL酶溶液。将上述各试管中溶液混合后于37℃水浴反应15 rain，625nm测定吸光度值。(注意：反应时间应严格控制，因葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，5．计算根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。6．说明①此法适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食品样品和血液样品。检出量为0．02 mg。②此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。③如果样品提取液为无色，不需做样品空白。有色样品或样品提取液浑浊，则应做样品空白以减少干扰。