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细胞工程论文
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。
【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
【参考文献】
1 Mligiliche N，Kitada M，Ide C.Grafting of detergentdenatured skeletal muscles provides effective conduits for extension of regenerating axons in the rat sciatic nerve〔J〕.Arch Histol Cytol，2001;64 (1):2936.
2 Fansa H，Keilhoff G，Forster G,et al.Acellular muscle with Schwanncell implantation：an alternative biologic nerve conduit〔J〕.J Reconstr Microsurg,1999;15(7):5317.
3 Gulati AK，Rai DR，Ali AM.The influence of cultured Schwann cells on regeneration through acellular basal lamina grafts〔J〕.Brain Res，1995;705(12):11824.
4 朱 梅，陈 东，盂晓婷，等.羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(2)：2279.
5 Meng XT，Chen D，Dong ZY,et al.Enhanced neural differentiation of neural stem cells and neurite growth by amniotic epithelial cells coculture〔J〕.Cell Biol Intern，2007;31：6918.
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7 Suh JK，Matthew HW.Application of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering：A review〔J〕.Biomaterials，2000;21(24)：258998.
8 Grande DA，Halberstadt C，Naughton G,et al.Evaluation of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts〔J〕.J Biomed Mater Res，1997;34(2):21120.
9 Fansa H，Schneider W，Wolf G,et al.Host responses after acellular muscle basal lamina allografting used as a matrix for tissue engineered nerve grafts〔J〕.Transplantation,2002;74(3):3817.
10 李培建,胥少汀.去细胞肌肉支架移植及神经生长因子对脊髓横断性损伤的修复作用〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2000;10(4)：2203.
11 Fansa H，Keilhoff G.Comparison of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.
12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA,et al.22 week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23：217990.
13 李培建，李兵仓，胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9)：5258.
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在一项新的研究中，来自美国普林斯顿大学的研究人员惊奇地发现，他们以为是对癌症如何在体内扩散---癌症转移---的直接调查却发现了液-液相分离的证据：这个生物学研究的新领域研究生物物质的液体团块如何相互融合，类似于在熔岩灯或液态水银中看到的运动。相关研究结果作为封面文章发表在2021年3月的Nature Cell Biology期刊上，论文标题为“TGF-β-induced DACT1 biomolecular condensates repress Wnt signalling to promote bone metastasis”。
论文通讯作者、普林斯顿大学分子生物学教授Yibin Kang说，“我们相信这是首次发现相分离与癌症转移有关。”
他们的研究不仅将相分离与癌症研究联系在一起，而且融合后的液体团块产生了比它们的部分之和更多的东西，自组装成一种以前未知的细胞器（本质上是细胞的一个器官）。
Kang说，发现一种新的细胞器是革命性的。他将其比作在太阳系内发现一颗新的星球。“有些细胞器我们已经认识了100年或更久，然后突然间，我们发现了一种新的细胞器！”
论文第一作者、Kang实验室博士后研究员Mark Esposito说，这将改变人们对细胞是什么和做什么的一些基本看法，“每个人上学，他们都会学到‘线粒体是细胞的能量工厂’，以及其他一些有关细胞器的知识，但是如今，我们对细胞内部的经典定义，对细胞如何自我组装和控制自己的行为的经典定义开始出现转变。我们的研究标志着在这方面迈出了非常具体的一步。”
这项研究源于普林斯顿大学三位教授实验室的研究人员之间的合作。这三位教授是Kang、Ileana Cristea（分子生物学教授，活体组织质谱学的领先专家）；Cliff Brangwynne（普林斯顿大学生物工程计划主任，生物过程中相分离研究的先驱）。
Kang说，“Ileana是一名生物化学者，Cliff 是一名生物物理学者和工程师，而我是一名癌症生物学家和细胞生物学者。普林斯顿大学刚好是一个让人们联系和合作的美妙地方。我们有一个非常小的校园。所有的科研部门都紧挨着。Ileana实验室实际上与我的实验室在Lewis Thomas的同一层楼! 这些非常紧密的关系存在于非常不同的研究领域之间，让我们能够从很多不同的角度引入技术，让我们能够突破性地理解癌症的代谢机制--它的进展、转移和免疫反应--也能想出新的方法来靶向它。”
这项最新的突破性研究，以这种尚未命名的细胞器为特色，为Wnt信号通路的作用增加了新的理解。Wnt通路的发现导致普林斯顿大学分子生物学教授Eric Wieschaus于1995年获得诺贝尔奖。Wnt通路对无数有机体的胚胎发育至关重要，从微小的无脊椎动物昆虫到人类。Wieschaus已发现，癌症可以利用这个通路，从本质上破坏了它的能力，使其以胚胎必须的速度生长，从而使肿瘤生长。
随后的研究揭示，Wnt信号通路在 健康 的骨骼生长以及癌症转移到骨骼的过程中发挥着多重作用。Kang和他的同事们在研究Wnt、一种名为TGF-b的信号分子和一个名为DACT1的相对未知的基因之间的复杂相互作用时，他们发现了这种新的细胞器。
Esposito说，把它想象成风暴前的恐慌购物。事实证明，在暴风雪前购买面包和牛奶，或者在大流行病即将到来时囤积洗手液和卫生纸，这不仅仅是人类的特征。它们也发生在细胞水平上。
下面是它的作用机制：惊慌失措的购物者是DACT1，暴风雪（或大流行病）是TGF-ß，面包和洗手液是酪蛋白激酶2（CK2），在暴风雪面前，DACT1尽可能多地抓取它们，而这种新发现的细胞器则把它们囤积起来。通过囤积CK2，购物者阻止了其他人制作三明治和消毒双手，即阻止了Wnt通路的 健康 运行。
通过一系列详细而复杂的实验，这些研究人员拼凑出了整个故事：骨肿瘤最初会诱导Wnt信号，在骨骼中传播（扩散）。然后，骨骼中含量丰富的TGF-b激发了恐慌性购物，抑制了Wnt信号传导。肿瘤随后刺激破骨细胞的生长，擦去旧的骨组织。( 健康 的骨骼是在一个两部分的过程中不断补充的：破骨细胞擦去一层骨，然后破骨细胞用新的材料重建骨骼)。这进一步增加了TGF-b的浓度，促使更多的DACT1囤积和随后的Wnt抑制，这已被证明在进一步转移中很重要。
通过发现DACT1和这种细胞器的作用，Kang和他的团队找到了新的可能的癌症药物靶点。Kang说，“比如，如果我们有办法破坏DACT1复合物，也许肿瘤会扩散，但它永远无法‘长大’成为危及生命的转移瘤。这就是我们的希望。”
Kang和Esposito最近共同创立了KayoThera公司，以他们在Kang实验室的合作为基础，寻求开发治疗晚期或转移性癌症患者的药物。Kang说，“Mark所做的那类基础研究既呈现了突破性的科学发现，也能带来医学上的突破。”
这些研究人员发现，DACT1还发挥着许多他们才开始 探索 的其他作用。Cristea团队的质谱分析揭示了这种神秘细胞器中600多种不同的蛋白。质谱分析可以让科学家们找出在显微镜玻片上成像的几乎任何物质的确切成分。
Esposito说，“这是一个比控制Wnt和TGF-b更动态的信号转导节点。这只是生物学新领域的冰山一角。”
Brangwynne说，相分离和癌症研究之间的桥梁仍处于起步阶段，但它已经显示出巨大的潜力。
他说，“生物分子凝聚物在癌症---它的生物发生，特别是它通过转移进行扩散---中发挥的作用仍然不甚了解。这项研究为癌症信号转导通路和凝聚物生物物理学之间的相互作用提供了新的见解，它将开辟新的治疗途径。”（生物谷 Bioon.com）
参考资料： 1.Mark Esposito et al. TGF-β-induced DACT1 biomolecular condensates repress Wnt signalling to promote bone metastasis. Nature Cell Biology, 2021, doi:10.1038/s41556-021-00641-w. 2.Kiran D. Patel et al. Condensing and constraining WNT by TGF-β. Nature Cell Biology, 2021, doi:10.1038/s41556-021-00649-2.
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