菌物的研究进展论文3000字数

0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 1.2方法 1.2.1表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.0 μL，DMSO 2.5 μL，4× dNTP混合物（每种2.5 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板3.5 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶0.5 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.1.2.2融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.1.2.3蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH 8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.1.2.4融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用0.5 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH 8.0) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.1.2.5CGGBP1与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果2.1原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为2.9 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.2.2CGGBP1的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 2.3CGGBP1蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.2.4CGGBP1与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.

1 、微生物的作用 1.1 微生物在物质循环中的作用 在生物圈内的物质循环过程中，以异样型微生物为主的分解者，在有机物的矿质化过程中有着不可替代的作用，它于生产者一起共同推动着生物内的物质循环，使生态系统保持平衡。例如，在碳素循环中，地球上 90% 的 co 2 是由微生物的生命活动产生的；在氮素循环中，固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用都有微生物的活动；在磷和硫的循环中同样也需要各种微生物的活动。 1.2 微生物与污水处理 工业迅猛发展的同时也给人们带来了一定的环境污染。在众多的污水、废水处理方法中，生物学的处理方法因具有经济方便、效果好的突出优点而被广泛应用。在污水的生物学处理过程中，微生物起着特别重要的作用，它们能将水体中的含碳有机物分解成 CO 2 、 H 2 s 、 CH 4 等气体；将含氮有机物分解成氨、硝酸、亚硝酸和氮；能使汞、砷等对人类有毒的重金属盐在水体中进行转化，以便于回收或除去，使许多病原性寄生生物常因与环境不适而死去。 1.3 有益于人体健康 人体肠道中含有很多种微生物，其中主要有大肠杆菌、产气杆菌、变形菌、粪产碱菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌和螺旋体等。人体为这些微生物提供了良好的栖息场所，而这些细菌生活在肠道中能合成核黄素、维生素 B12 维生素 K 等多种维生素以及氨基酸以供人体吸收利用。 2 、微生物的污染 2.1 工业产品中的微生物 各种工业器材，如金属、仪表、电讯器材、绝缘材料和纺织品等，它们或含有一些可被微生物利用的成分，或因种种原因沾染了或多或少的有机物质，因此，都会受到微生物的侵蚀，使之老化变质。 2.1.1 铝及其合金制品受到微生物的侵蚀。例如，曾发生过飞机的油槽因受到牙枝霉、铜绿色假单胞菌和弧菌等的腐蚀而漏油。飞机机翼的内铝壁也受到上述微生物的侵蚀。钢铁及其制品因长期与水或土壤接触，受到铁细菌、硫细菌、硫酸还原细菌等的作用而腐蚀。电子设备、集成电路、绝缘材料等均可受到霉菌的侵蚀，由于霉菌的菌丝能导电，因此常能引起有关设备的失灵。 2.1.2 羊毛、棉纱、尼龙、聚制脂及其制品，也常受到微生物的侵蚀。污染漾奶、毛的微生物主要有铜绿色假单胞杆菌、微球菌、枯草杆菌、曲霉、青霉等。污染棉织品的主要是纤维素分解菌群的微生物。污染尼龙的有球二孢和红曲霉等。微生物不仅能使纤维及其制品变质，而且与人体健康密切相关。例如，微球菌能使人的头部生白斑，铜绿假单胞菌与支气管炎、咽炎和耳、鼻、眼的炎症有关。 2.1.3 玻璃及其制品和显微镜、望远镜及照相机等器材的光学部分在温暖潮湿的条件下，都会由于曲霉、青霉等的生长繁殖而受腐蚀。 2.2 农业产品中的微生物 粮、油原料极其制品，含有丰富的养分，它们是微生物的天然营养基地，如果其他条件适宜，霉菌、细菌、酵母菌等微生物就会迅速地繁殖起来。 2.2.1 肉、蛋、奶、水果和蔬菜等食品的表面都生活着很多的微生物，如果保存不当，常引起食品的变质和腐败。 2.2.2 罐头是人们保存食品的方法之一，但肉类罐头中存在着枯草杆菌、梭菌等菌群。由于芽孢的抗热性很强，在罐头制作过程中虽然经过了高温处理，而在一些肉类罐头中仍能检测出嗜热脂肪芽孢杆菌、耐热厌气性的腐败梭菌等，它们是造成罐头腐败的主要原因。 3 、防止微生物污染的措施 3.1 防止贮粮霉变和真菌霉素污染的措施是：入仓前应降低粮食的含水量，除去破损、色变和霉变的籽粒；入仓后应创设干燥、低温和缺氧的环境，使霉菌失去生长繁殖的条件。 3.2 工业器材的防腐问题，日益受到人们的重视。目前分别采用对人和动物安全性高的高效杀菌剂，选用抗微生物腐蚀性的材料及含抗菌物质的材料做成涂膜，使器材和微生物隔离，以防止微生物的危害。