类胡萝卜素的研究进展论文

微生物育种-诱变育种摘要：分析了近几年来我国常用的几种物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等, 为微生物诱变育种提供了依据。综述了其在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素、杀虫剂等高产菌种选育中的应用进展;对该技术与离子束技术、空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了展望。关键词：诱变；微生物育种；应用进展；展望 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切, 其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏,甚至影响人们的日常生活质量,所以培育优质、高产的微生物菌株十分必要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导, 或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状, 人为地使某些代谢产物过量积累,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前,国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。此外,原生质体诱变技术已广泛地应用于酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素等的菌种选育中,并且取得了许多有重大应用意义的成果。1、诱变育种1.1物理诱变1.1.1紫外照射紫外线照射是常用的物理诱变方法之一, 是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰在260nm, 因此在260nm 的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释,但比较确定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对,所以可能导致突变甚至死亡[2]。紫外照射诱变操作简单,经济实惠,一般实验室条件都可以达到,且出现正突变的几率较高,酵母菌株的诱变大多采用这种方法。1.1.2电离辐射γ- 射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一,具有很高的能量,能产生电离作用,可直接或间接地改变DNA 结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基,或者脱氧核糖的化学键和糖- 磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使水或有机分子产生自由基, 这些自由基可以与细胞中的溶质分子发生化学变化,导致DNA 分缺失和损伤[2]。除γ- 射线外的电离辐射还有X- 射线、β- 射线和快中子等。电离辐射有一定的局限性,操作要求较高,且有一定的危险性,通常用于不能使用其他诱变剂的诱变育种过程。1.1.3离子注入离子注入是20 世纪80 年代初兴起的一项高新技术,主要用于金属材料表面的改性。1986 年以来逐渐用于农作物育种,近年来在微生物育种中逐渐引入该技术[3]。离子注入时,生物分子吸收能量,并且引起复杂的物理和化学上的变化,这些变化的中间体是各类活性自由基。这些自由基,可以引起其它正常生物分子的损伤,可使细胞中的染色体突变,DNA 链断裂,也可使质粒DNA 造成断裂。由于离子注入射程具有可控性, 随着微束技术和精确定位技术的发展,定位诱变将成为可能[4]。离子注入法进行微生物诱变育种, 一般实验室条件难以达到,目前应用相对较少。1.1.4 激光激光是一种光量子流,又称光微粒。激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合应用,直接或间接地影响有机体,引起细胞染色体畸变效应、酶的激活或钝化,以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发生作用, 都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异。不同种类的激光辐射生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同[5]。激光作为一种育种方法,具有操作简单、使用安全等优点,近年来应用于微生物育种中取得不少进展。1.1.5 微波微波辐射属于一种低能电磁辐射, 具有较强生物效应的频率范围在300MHz~300GHz,对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升。从而引起生理生化反应;非热效应指在微波作用下,生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下,生物体会产生一系列突变效应[6]。因而,微波也被用于多个领域的诱变育种,如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种,并取得了一定成果。1.1.6 航天育种航天育种,也称空间诱变育种,是利用高空气球、返回式卫星、飞船等航天器将作物种子、组织、器官或生命个体搭载到宇宙空间, 利用宇宙空间特殊的环境使生物基因产生变异,再返回地面进行选育,培育新品种、新材料的作物育种新技术。空间环境因素主要有微重力,空间辐射,以及其它诱变因素如交变磁场,超真空环境等,这些因素交互作用导致生物系统遗传物的损伤,使生物发生诸如突变、染色体畸变、细胞失活、发育异常等。航天育种较其它育种方法特殊, 是航天技术与微生物育种技术的有机结合,技术含量高,成本高,个体研究者或一般研究单位都难以实现,只能与航天技术相结合,由国家来完成。2．1 化学诱变2.1.1 烷化剂烷化剂能与一个或几个核酸碱基反应,引起DNA 复制时碱基配对的转换而发生遗传变异, 常用的烷化剂有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等。甲基磺酸乙酯( ethylmethane sulphonate ,EMS) 是最常用的烷化剂,诱变率很高。它诱导的突变株大多数是点突变，该物质具有强烈致癌性和挥发性,可用5%硫代硫酸钠作为终止剂和解毒剂。N- 甲基- N'- 硝基- N- 亚硝基胍( NTG) 是一种超诱变剂,应用广泛,但有一定毒性,操作时应该注意。在碱性条件下,NTG 会形成重氮甲烷(CH2N2),它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2 对DNA 的烷化作用引起的[2]。硫酸二乙酯( DMS) 也很常用,但由于毒性太强,目前很少使用。乙烯亚胺,生产的较少,很难买到。使用浓度0.0001%~0.1%,高度致癌性,使用时需要使用缓冲液配置。2.1.2 碱基类似物碱基类似物分子结构类似天然碱基,可以掺入到DNA 分子中导致DNA 复制时产生错配,mRNA 转录紊乱,功能蛋白重组,表型改变。该类物质毒性相对较小,但负诱变率很高,往往不易得到好的突变体。主要有5- 氟尿嘧啶( 5- FU) 、5- 溴尿嘧啶( 5- BU) 、6- 氯嘌呤等。程世清等[25]用5- BU 对产色素菌( 分枝杆菌T17- 2- 39) 细胞进行诱变,生物量平均提高22.5%.2．1.3 无机化合物诱变效果一般,危险性较小。常用的有氯化锂,白色结晶,使用时配成0.1%~0.5%的溶液, 或者可以直接加到诱变固体培养基中,作用时间为30min～2d。亚硝酸易分解,所以现配现用。常用亚硝酸钠和盐酸制取,将亚硝酸钠配成0.01~0.1mol/L 的浓度, 使用时加入等浓度等体积的盐酸即可。2.1.4 其他盐酸羟胺,一种还原剂,作用于C 上,使G- C 变为A- T。也较常用,使用浓度为0.1%～0.5%,作用时间60min～2h。此外,诱变时将两种或多种诱变因子复合使用,或者重复使用同一种诱变因子,效果更佳。顾正华等[7]以谷氨酸棒杆菌ATCC- 13761 为出发菌株,经DMS 和NTG 多次诱变处理,获得一株L- 组氨酸产生菌。2、诱变剂2.1 诱变剂的选择在选择诱变剂时, 需要注意诱变剂的专一性, 即某一诱变剂或诱变处理优先使基因组的某些部分发生突变而别的部分即使有也很少发生突变。对诱变剂专一性的分子基础不十分了解万尽管有关的修复途径必定对此有影响, 但它们的关系并不那么简单, 其它各种因素,包括诱变处理的环境条件也能影响突变类型。工业遗传学家很难正确地预言改良某一菌种时需要何种类型的分子水平的突变。因此, 为了产生类型尽可能多的突变体, 最适当的方法是采用几种互补类型的诱变处理。远紫外无疑是所有诱变剂中最为合适的, 似乎可以诱导所有已知的损伤类型。采取有效、安全的预防方法也很容易。在化学诱变剂中, 液体试剂比粉末试剂更易进行安全操作。的另一个不利因素是它有产生紧密连锁的突变丛的趋势, 尽管这种效应在某些体系中能成为有利条件。最后, 必须认识到可能某些特异菌系用某些诱变剂是不能被诱变的。当然这一点通过测定易检出的突变体, 如抗药性突变体或原养型回复突变体的诱变动力学可以相当容易地得到验证。[8]2.2 诱变剂的剂量从随机筛选的最佳效果看, 诱变剂的最适剂量就是在用于筛选的存活群体中得到最高比例的所需要的突变体, 因为这会使在测定效价的阶段更省力。因此在菌株改良以前,为了决定所用诱变剂的最适剂量, 并为突变性的增强技术打下基础, 聪明的做法通常是测定不同诱变剂处理不同菌种时的突变动力学。用高单位突变本身来测定最适剂量有时是不可能的, 因为这种突变的检测很困难。但如使用容易检出的标记如耐药标记, 只要估计到方法的局限性, 还是可以提供一些有价值的资料的。[9]3、原生质体诱变在工业微生物育种中的应用进展3.1 在酶制剂菌种选育中的应用酶制剂是活的有机体产生的有催化活性的蛋白质,是所有新陈代谢过程必不可少的要素。应用原生质体诱变技术对酶制剂的生产菌株进行诱变,已经获得了许多高产菌株。胡杰等[10 ]对沪酿(Aspergillus oryzae) 31042米曲霉的原生质体进行紫外线-氯化锂、N-甲基- N′-硝基-N - 亚硝基胍( N - methyle - N′- nitro - N -nitrosogunidinc, NTG)复合诱变,筛选到8 株高产中性蛋白酶突变株群,其中最高产酶活力为出发菌株的1162倍,为以后的细胞融合、基因组改组等提供了优良的候选文库。3．2抗生素高产菌种选育中的应用抗生素是微生物细胞的次级代谢产物,目前主要采用微生物发酵法进行生物合成。由于生产菌种产量的高低受多步代谢调控的制约,高产菌株的选育也很困难。原生质体诱变作为一种诱变技术,在抗生素的高产菌种选育中已有着广泛的应用。朱林东等[ 11 ] 通过紫外线诱变始旋链霉菌( S treptom ycespristinaespiralis)的原生质体, 得到了产普那霉素为1159g/L的高产突变株,比出发菌株提高10113%。3.3 在氨基酸、生产溶剂及有机酸菌种选育中的应用氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位,在食品、饲料、医药、化学工业、农业等行业中应用广泛,各国都在大力发展氨基酸生产。发酵法已成为氨基酸生产的主要方法。因此选育高产菌株是氨基酸工业发展的重要方向。生产溶剂和有机酸是微生物的初级代谢产物,原生质体诱变技术在生产溶剂和有机酸生产菌种选育中也取得了成效。3.4 生素菌种选育中的应用维生素是维持人和动物生命活动必需的、但不能自身合成的一类有机物质,在生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。韩建荣等用激光处理青霉( Penicillium sp) PT95 的原生质体,选育到一株菌核生物量和类胡萝卜素含量均有显著提高的突变株L05。该突变株的菌核生产量提高98.6% ,菌核中的类胡萝卜素含量提高28.3% ,类胡萝卜素产率的增加幅度达到154.0%。3.5 虫菌种选育中的应用苏云金杆菌(B acillus thuringiensis)是从自然界中筛选出来的一大类细菌型微生物杀虫剂,多应用于农林害虫的防治中。王丽红等[ 12 ] 对苏云金杆菌NU- 2的原生质体进行紫外线-氯化锂复合诱变,筛选到的突变株发酵周期从44h缩短到40.3h,晶体蛋白含量提高10.03%。4、 展望未来近年来,随着新的诱变源的出现,原生质体诱变技术的应用也会有新的进展。离子束作为一种新的诱变源,有其特有的作用机理[ 13 ] ,使得离子束诱变具有诱变谱广、变异幅度大、突变率高等优点,其应用也取得了很多重要的成果,特别是运用离子注入选育Vc菌株的成功,为我国的VC 行业增添了活力。航天搭载的微生物菌种,能借助微重力、空间辐射、超真空等综合空间环境因素的转换,在较短时间里创造目前其它育种方法难以获得的罕见基因突变,以此来进行微生物育种是空间技术育种的一个重要的应用领域。利用空间技术对某些抗生素的产量提高及酶制剂研究曾有些可喜的结果。将离子注入、空间技术与微生物原生质体技术结合起来,微生物原生质体诱变技术将会有更加广阔的应用前景。5、结语随着遗传学和分子生物学领域的飞速发展, 许多新型复杂的技术被应用于菌种选育, 如原生质体融合育种技术和基因工程育种技术等, 但是诱变育种技术仍是提供菌株生产能力的重要有效手段。它获得的正突变率相对较高,可以得到多种优良突变体和新的有益基因类型。另一方面,诱变育种存在一定的盲目性和随机性,在实际应用中,研究者应根据出发菌株及实验室条件等具体情况来选择合适的诱变方法。本实验室将物理因子和化学因子结合起来对多种酵母菌株进行复合诱变,均得到了理想菌株。此外,我们正在尝试反复采用几种诱变因子进行多次诱变,以期得到更为理想的菌株。参考文献：[1] Madigan,M.T(美),MartinkoJ.M(美),Parker,J.(美).微生物生物学[M].北京:科学出社,2001:390.[2] 曹友声,刘仲敏.现代工业微生物学[M].长沙:湖南科学技术出版社,1998.[3] 陈义光,李铭刚,徐丽华,等.新型物理诱变方法及其在微生物诱变育种中的应用进展[J].长江大学学报,2005,2(5):46- 48[4] 余增亮.离子注入生物效应及育种研究进展[J].安徽农学院学报,1991,18(4):251- 257.[5] 胡卫红.激光辐照微生物的研究概况[J].激光生物学报,1999,8(1):66- 69.[6] Leach WM.Genetic,growth and reproductive effects of microwave radiation[J].Bull NYAcademicMedicine,1980,55(2):249- 257.[7]顾正华.L- 组氨酸产生菌的选育[J].无限轻工大学学报,2002,21(5): 533- 535.[8]施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学(2 版)[M].北京:科学出版社,2003:1- 4,76- 78.[9]戴四发, 黎观红, 吴石金.现代工业微生物育种技术研究进展.微生物学杂志, 2000 年6 月, 20 卷, 2 期.[ 10] 胡杰,潘力,罗立新,等1米曲霉孢子原生质体复合诱变及高活力蛋白酶菌株选育[ J ]1食品工业科技, 2007, 28 (5) :116～1191[ 11 ] 朱林东,金志华1普那霉素产生菌的原生质体诱变育种[ J ]1中国抗生素杂志, 2006, 31 (10) : 591～5941[ 12 ] 王丽红,郭爱莲1苏云金杆菌NU- 2原生质体复合诱变的研究[ J ]1微生物学杂志, 2006, 26 (4) : 23～261[ 13 ] Huiyun Feng, Zengliang Yu, Paul K Chu1 Ion imp lantationof organisms [ J ] 1Materials Science and Engineering, 2006, 54(3- 4) : 49～1201