氧化损伤毕业论文

谷胱甘肽(GSH)是广泛存在于细胞内的小分子三肽化合物，它参与细胞内氨基酸转运、糖代谢和DNA合成调节，在拮抗外源性毒物、氧自由基损伤、调节机体免疫功能、维持细胞蛋白质结构和功能、抑制细胞凋亡等方面发挥着重要作用［1］。多年来，人们试图根据GSH被氧化还原的程度来评估氧自由基脂质过氧化损伤，并取得了不少进展。 一、谷胱甘肽的一般生理特性 GSH由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，是细胞内呈液态、含巯基最为丰富的一类化合物，半胱氨酸α氨基上的-SH为该分子化合物活性中心。GSH在不同脏器浓度不同，以肝内最高，依次为脾、肾、肺、脑、心、胰和骨髓，血液中浓度最低［2］；同一器官不同部位浓度相差亦较大，而同一细胞内不同细胞器间GSH含量亦不一致。 谷胱甘肽氧化型(GSSG)为GSH的氧化形式，在氧化剂作用下GSH通过GSH-过氧化物酶（GSH-Px）氧化成GSSG；后者通过NADPH供氢，在谷胱甘肽还原酶（GSH-Rx）作用下又还原成GSH，二者构成一动态平衡，使GSSG维持在总GSH量的1％～10％水平［3］，构成一有效的抗氧化系统。生理状态下，GSH/GSSG维持在高比率，而在氧化应激时，GSH氧化成GSSG，GSH/GSSG比率下降，故可借以评估脂质过氧化损伤情况。 GSH合成主要在肝内，其合成除与半胱氨酸及NADPH含量有关外，其合成限速酶谷胱甘肽合成酶（GCS）亦有重要作用。GCS有2个亚基GCLR和GCLS，以GCLR为主，GCLS起调节作用。在氧化状态，GCLR的mRNA高表达且有剂量依赖性，而低水平GSH对GCLR的mRNA影响则不明显；相反，抑制GSH-Rx后，GCLR的mRNA则高表达，提示GSSG对GCLR有调节作用，并进而反馈性调节GSH水平［4］。GSH清除主要在肾脏，占血循环总量50％～65％，双肾动脉中80％的GSH和GSSG经一次肾循环后被滤过，但可经Na+-依赖性GSH酶转运系统重吸收。 二、GSH拮抗自由基脂质过氧化损伤机理 GSH在拮抗氧化性毒物中发挥重要作用，一方面可与毒物分子及其代谢物发生结合反应降低毒物毒性；另一方面可通过氧化还原反应而降低毒物过氧化的能力，使含巯基酶免于被重金属和氧化剂激活或使已氧化的含巯基酶还原而使其恢复活性。 在自由基大量产生时，细胞膜不饱合脂肪酸氧化成脂过氧基，并引起一系列继发损伤。GSH可直接通过供H+拮抗氧自由基毒性，终止连锁反应，其本身则被氧化成GSSG。同样，GSH在对抗氧自由基过氧化并抑制由此引发的细胞凋亡、坏死及自稳态改变等方面亦发挥着重要作用。 GSH/GSSG体内代谢有多种途径，在氧化状态下，GSH一方面被氧化成GSSG，表现为相应GSH/GSSG的降升；另一方面，GSH与外源毒物及其代谢物发生结合反应，最终生成硫醇脲酸经尿排出，此时仅为相应GSH下降，而GSSG变化可能并不大，甚或因GSH消耗而GSSG亦降低［5］。GSSG除可被还原成GSH外，还可通过GST（谷胱甘肽-S-转移酶）发生结合反应。 三、体内影响GSH水平因素 由于血中GSH主要源于肝脏等器官，所以血浆GSH水平无疑是间接反映有关器官，如肝、肾内GSH水平的较理想指标。目前测定仍多停留在动物实验阶段，有关人血GSH浓度报道较少，近期报道人血浓度为1.000±0.167(715例)［1］。 在许多病理情况下，如糖尿病、酒精性肝病、肝硬化、外源性毒物致过氧化时，GSH水平下降。近期又发现艾滋病、帕金森病、衰老及低氧血症病人的GSH也下降，并发现老年人伴GSH低下者的身体健康状况较高GSH者差。 Hagg等报道，在生理状态下男性GSH水平高于女性，素食者高于非素食者，老年人GSH明显下降，黑人GSH高于白种人［1，6］。另外人们还发现，GSH水平与体育活动程度及营养有关。有趣的是，吸烟者GSH高于非吸烟者，这可能是机体对长期吸烟引起慢性氧化状态的适应性调节反应，这也进一步提示，GSH在体内抗氧化过程中的重要作用。 四、不同化学毒物诱导的脂质过氧化状态下GSH/GSSG的变化 体外试验显示，当细胞暴露于亚毒性浓度毒物时，GSH并不下降而是升高。 Cookson等［7］用神经胶质细胞分别与亚毒性浓度三甲基锡、三乙基锡共同培养24小时，细胞内GSH显著升高；Ochi［8］用中国仓鼠V79细胞与亚毒性浓度砷共同孵育时，发现在8小时GSH升高最大，之后降低；另外，亦有大量试验显示暴露于亚毒性浓度的铅、汞、甲基汞等化合物亦使GSH升高［9］，提示可能是细胞在应激时采取的一种保护性机制，与长期吸烟致GSH升高情况类似。 Palmeira等［10］将雄性Wistar大鼠肝细胞分别和不同毒性浓度的除莠剂百草枯和2,4-D共同进行体外培养，用Hissin酶化学法检测GSH/GSSG。结果显示，GSH浓度随接触时间而降低，孵育2～3小时降至最低水平，且存在剂量-反应关系，而GSSG则呈正比升高。Lora等用雄性Fischer344大鼠与不同浓度的双氯乙基亚硝脲一起孵育并采用反相高效液相色谱（HPLC）法检测GSH/GSSG水平，亦得出同样结论［11］。 而在体内实验，情况则复杂得多。Stone等［12］以不同浓度的维生素K3(0、30、60和100 μmol/L)对鼠染毒，用Hissin-Hilf酶化学法分别测定GSH/GSSG，结果显示GSH降低及GSSG升高具有剂量依赖关系，但GSH下降与GSSG升高不成等比例，当GSH值(μmol/g)由1.45±0.28降到0.57±0.07时(61％)，GSSG此时升高仅为GSH丢失的10％。有研究用甲醇(3.0和6.0 g/kg)对雄性大鼠染毒，并分别于不同时间测其肝细胞、红细胞及血浆GSH/GSSG，结果显示3.0 g/kg组GSH 12小时达最低，从4.4 μmol/g降至3.4 μmol/g(P＜0.05)，其后缓慢恢复，GSH-Px、GSH-Rx活性与GSH亦同步升降，但GSSG变化则不明显，这可能是由于GSH与新生成的甲醛直接结合而未生成GSSG［13］。另有实验则显示由于GSH与毒物结合，GSSG生成也减少，GSH/GSSG比率反较前升高［5，13］。 有些实验显示，外周血GSSG变化较GSH敏感，这可能与细胞受损后GSH、GSSG释放到细胞外水平不同有关。Navarro等［14］对成年OF1小鼠给予1～7 Gy的高能X线照射，并在不同时间测其血中GSH/GSSG。此外，对患乳腺癌及肺癌病人在接受不同剂量放射治疗时亦采用HPLC法测定上述指标，结果显示小鼠血中GSH浓度变化不显著，GSSG升高，GSH/GSSG下降，并与放射剂量有剂量和时间依赖性，尤以2 小时GSSG升高最显著；鼠肝、心、胰腺中变化亦明显，且同时有GSH下降并有统计学意义；肿瘤放疗病人结果亦显示外周血GSSG水平则随放疗累积量增加而升高，并有显著统计学意义，而GSH变化则不显著。 但在以该指标评估脂质过氧化损伤时，尚需注意到GSH/GSSG系统的参与情况。Lii等［15］采用雄性SD大鼠，分别予以百草枯(20和40 g/kg)、敌草快（85和190 mg/kg)染毒，结果见肝细胞GSH和GSSG及其比率变化均无统计学意义，而此时通过检测氧自由基脂质过氧化产物硫巴比土酸反应物，则显示肝细胞有较严重氧自由基脂质过氧化损伤，这可能与蛋白质-S-谷胱甘肽化有关，GSH/GSSG 系统则可能未参与上述过程。 以GSH/GSSG作为指标评估脂质过氧化损伤，诸多实验结果有不小差异，可能与以下因素有关： 1．测量方法：检测GSH/GSSG方法有多种，归纳起来主要有2类：酶化学法和HPLC法。前者主要根据GSH在氧化还原过程中酶代谢动力学改变，如利用GSH被二硫代对二硝基苯氧化，生成硫硝基苯酸盐的程度，间接反应GSH/GSSG的水平。HPLC法则可据实验波谱直接测定GSH/GSSG，敏感性、专一性较高，但操作复杂。两种方法的结果多数一致［1，15］，而Floreani等［16］则认为HPLC较化学法敏感10倍以上，两方法所测结果有显著差别，但都面临同样问题，如GSH/GSSG在细胞内隔窒化(compartmentilization)和样本的预处理等。 2．质量控制：GSH接触到空气时，如不用稳定剂，可迅速被氧化而消耗；在不同温度下，其稳定性亦不一，如血样获取后立即在-70℃冷冻，GSH至少可保持3周，但在-20～4℃，GSH逐渐降解；而加入稳定剂后，-20℃下可存放1年，室温下亦可放置1天。所以样品的预处理对所测结果有直接而十分重要的影响。 3．机体的多抗氧化体系和GSH/GSSG代谢的多途径：如机体通过蛋白质-S-谷胱甘肽化、碳酸酐酶Ⅲ发挥保护细胞作用等，此时GSH/GSSG系统并未参与抗氧化代谢；生理状态下GSH/GSSG防御系统受到诸多酶活性制约，而病理状态下酶活性的改变亦会影响GSH/GSSG水平；GSH和GSSG还有着多种代谢途径，如GSSG不升高，可以反映低水平脂质过氧化或低GSH含量，但亦可能因GSH与毒物直接结合而不形成GSSG或新产生的GSSG又发生新结合反应等。 综上所述，GSH/GSSG可作为评价氧自由基脂质过氧化损伤的较敏感指标，并可借以探究毒物毒性机理，但仍需要根据毒物种类、浓度和相互作用时间等不同，对GSH/GSSG做综合分析；此外，GSH/GSSG作为氧自由基损伤指标的研究目前仍多处于动物实验阶段，而对人体研究则较少，对其特异性的提高仍是有待解决的问题。应用到对人群的监控或对临床中毒病人的评估仍有一定距离。 作者单位：100020 北京市劳动卫生与职业病防治研究所 参考文献 1 Richie JP Jr, Skowronski L, Abraham P，et al. 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医学论文写作提纲

医学，是通过科学或技术的手段处理人体的各种疾病或病变的学科，对它的研究更利与社会的发展。

摘要 4-7

Abstract 7-10

英文缩略词 11-12

目录 12-14

前言 14-16

第一章 氧化应激模型的建立 16-29

引言 16-17

第一节 实验方法 17-20

1 仪器与材料 17-18

2 N2a细胞的培养 18-19

3 氧化应激模型的建立 19-20

4 在光学显微镜下观察细胞之形态 20

第二节 实验结果 20-26

1 不同浓度过氧化氢对N2a细胞作用相同时间的结果 20-24

3 80μM过氧化氢氧化损伤N2a细胞不同时间的形态变化 24-26

第三节 讨论 26-28

第四节 结论 28-29

第二章 氧化应激状态下CDK1对caspase-2活性及高尔基体形态的.影响 29-51

引言 29-30

第一节 实验方法 30-38

1 仪器与材料 30-31

2 N2a细胞培养 31

3 流式细胞术及Hoechst染色检测细胞凋亡情况 31-33

4 Western blot检测caspase-2的表达 33-36

5 分光光度法检测caspase-2活性 36-37

6 免疫荧光观察高尔基体形态 37-38

7 统计学分析 38

第二节 实验结果 38-46

1 抑制CDK1活性对氧化应激中N2a细胞凋亡率的影响 38-40

2 Caspase-2的表达及活性的变化 40-41

3 免疫荧光观察高尔基体形态 41-45

4 Hoechst染色观察细胞核 45-46

第三节 讨论 46-50

1 高尔基体应激 46

2 CDK1对氧化应激中N2a细胞损伤的影响 46-47

3 CDK1对高尔基体形态的影响 47

4 CDK1与caspase-2活性的关系 47-48

5 总结 48-50

第四节 结论 50-51

参考文献 51-55

综述 55-61

参考文献 58-61

致谢 61-62

摘要 4-6

Abstract 6-7

目录 8-10

符号说明 10-11

1 导论 11-14

2 HLA-G结构功能、作用机制以及在各种病理过程中的作用 14-37

2.1 初步介绍 14-15

2.2 HLA-G的结构功能、作用机制及其在多种病理情况下的作用与应用 15-36

2.2.1 HLA-G的各种结构 15-17

2.2.2 HLA-G及其受体表达的调控 17-19

2.2.3 HLA-G在免疫突触诱导免疫耐受的机制 19-22

2.2.4 HLA-G1通过膜片转移的作用机制 22-24

2.2.5 HLA-G诱导抑制性调节T细胞的形成 24-28

2.2.6 HLA-G诱导移植耐受 28-31

2.2.7 HLA-G在肿瘤免疫逃逸和免疫治疗中的作用 31-33

2.2.8 HLA-G与妊娠免疫耐受 33-34

2.2.9 HLA-G与炎症性疾病和自身免疫性疾病 34-35

2.2.10 HLA-G与感染性疾病 35-36

2.3 结束语和未来的展望 36-37

3 HLA-G诱导大鼠肾移植免疫耐受的实验研究 37-46

3.1 建立携带HLA-G基因的慢病毒表达体系 37-43

3.1.1 实验目的 37

3.1.2 实验材料 37

3.1.3 实验方法 37-43

3.2 包装慢病毒 43-45

3.2.1 实验目的 43

3.2.2 实验材料 43-44

3.2.3 具体包装(慢病毒)步骤 44

3.2.4 通过有限稀释法,测定慢病毒滴度 44-45

3.2.5 注意事项 45

3.3 实验结果与结论 45-46

4 建立大鼠肾移植急性排斥反应模型 46-56

4.1 实验目的 46

4.2 实验材料与方法 46-51

4.2.1 实验材料 46-47

4.2.2 实验方法 47-51

4.3 统计分析 51

4.4 实验结果 51-53

4.4.1 肾移植急性排斥反应模型的建立及手术成功率 51-52

4.4.2 手术时间 52

4.4.3 术后病理切片 52-53

4.5 实验讨论与结论 53-56

5 HLA-G慢病毒在大鼠排斥模型中转染移植肾诱导免疫耐受的实验研究 56-64

5.1 引言 56-57

5.2 实验材料与方法 57-59

5.2.1 大鼠肾移植与标本采集 58

5.2.2 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR) 58

5.2.3 Western印迹检测 58-59

5.3 实验结果 59-61

5.4 实验讨论 61-64

6 HLA-G慢病毒转染诱导免疫耐受的细胞实验研究 64-70

6.1 实验目的 64

6.2 实验材料 64

6.3 实验方法 64-69

6.3.1 细胞转染实验 64-65

6.3.2 RT-PCR的实验步骤 65-66

6.3.3 Western Blot实验步骤 66-67

6.3.4 应用MTT法法检测人类和大鼠内皮细胞表达HLA-G对健康人和大鼠NK细胞杀伤活性的影响： 67-69

6.4 实验讨论与结论 69-70

参考文献 70-76

综述 76-86

参考文献 84-86

在读期间发表的文章及获奖 86-87

致谢 87