第一代测序技术相关论文文献

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测序，简单来说就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。 一代测序 首先讲一下测序的基础方法，Sanger测序 (Sanger et al.,1977) 1977年Frederick Sanger和同事发展出双脱氧测序法（dideoxy sequencing method）或称链终止法，并对噬菌体phiX-174测序以来，测序原理并未有太多变化。后来测序方法的改革也几乎都是在此基础上，缩短时间，降低人力，比如①在每一种ddNTP中掺入不同的荧光标记，使测序在单一反应中就能进行。②使用极薄极长的充胶玻璃毛细管代替大的聚丙烯酰胺凝胶块，新的介质散热更快，使电泳能在高压下进行，降低分离时间等诸如此类的减少分离时间的变革。③更换探查单一核苷酸的方法，用微转换器控制通过的电流检测核苷酸等等。 Sanger法测序需要引物，DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）。按照碱基配对原则，dNTPs在引物之后按照模板延伸，ddNTPs的随机加入会由于它缺乏连接下一个的3’羟基而导致反应终止，由于ddNTPs的结合位置随机，我们会得到一系列大小不同的片段，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或同位素标记进行检测。也正是这个原理，所以测序得到较长的序列的概率低，长序列往往需要双向测序再进行拼接。Maxam gilbert 化学法测序 (Maxam and Gilbert,1977) 几乎同时，Maxam和Gilbert发明了化学链降解法测序。 通过化学终止反应测序。首先双链变单链，准备工作完成。采用特定的化学试剂来从DNA链上断裂特定碱基，在5’端磷酸化（32P），四种化学反应：G反应，A+G反应，T+C反应，C反应，分别进行并产生一系列片段。然后进行电泳（electrophoresis），放射自显影（radioautography），最后可以整理得到序列。二代测序（目前拥有这些测序仪的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收购life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官网可以找到这些测序仪），Roche） 一些和前后都没有紧密联系的概念 深度测序（deep sequencing）不是什么测序方法，而是根据对目的基因测序的depth和coverage（C）对测序方法的归类。如果这个片段被测序了大于7次（coverage>7），那么基本可以说是深度测序，大于100×称为ultra deep sequencing。还有一些概念比如length of genome（G）指全基因组长度，number of reads（N）片段数量，average read length（L）。 C=N×（L/G） pyrosequencing 焦磷酸测序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代测序 (Jarvie, 2005) 焦磷酸测序法 它后来发展称为Roche公司454技术所使用的测序方法。 是一种酶联级联测序技术，准确度可与Sanger媲美，且速度大大提高。具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量，低成本，快速地进行单核苷酸多态性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技术支持。改进后的焦磷酸测序技术可以满足上百个核苷酸测序。但是测序长度一般在100bp左右，一直用于短序列分析。它的技术原理是4种酶在同一反应体系种级联化学发光反应，引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），荧光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）协同作用下，检测荧光，实时测定DNA序列。454测序-固定的焦磷酸测序体系（2016年被Roche公司淘汰） 首先是序列处理：全基因组DNA处理为小的片段（鸟枪法处理的），在一端连接两端分别连接A和B（可以在PCR中产生大量的目的序列），然后解链变成带有adaptors的单链DNA，这个adaptorA的序列可以与小珠子上面的短序列B匹配，这样我们要测序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且与酶不反应的分子，作为固定表面。然后进行乳化PCR，得到了满载分子的小珠子并将它们放入小孔。接下来是焦磷酸测序的原理，引物是adaptorA，每次反应加一种dNTP，如果可以碱基配对，会在DNA聚合酶下结合在引物末端，释放一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi与APS结合形成ATP，ATP与荧光素在荧光素酶作用下形成氧化荧光素，产生可见光。反应后冲洗掉剩余dNTP和少量ATP。 大多数现代测序方法都是分为这几步，主旨是实现高通量和自动化。①全基因组片段化。②adapter ligation末端连接短序列。③目标DNA与分子小珠子的结合。④将小珠子加载到孔板。⑤采用适合的方法测序。⑥数据处理。 连接酶法测序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID测序  (Hedges et al.,2011) 连接酶测序法 利用的是DNA ligase的一个特性。连接酶是将DNA分子末端连接在一起的酶，它对DNA结构敏感，如果两条链的碱基不匹配，那么酶的效率很低。 具体如下图，模板链连接P1Adaptor，引入引物Pn与探针寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前两个是与模板结合的碱基，中间三个为universal配对，后三个也是且5’连接荧光标记。在酶的作用下，正确配对的探针偏向与模板结合，然后荧光信号被检测并切除，露出5’端，继续反应。中间NNN的碱基部分可以通过加入引物Pn-1的方法，进行错位测序，之后整合数据。ABI公司SOLID测序平台 在前期准备上与454测序相似，也会用到小分子的beads。但是测序方法为连接酶法，不是焦磷酸。鸟枪法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 测序- Ion torrent 公司PGM测序 (Merriman et al.,2012) 鸟枪法 传统的sanger法适合短一些的序列，当处理比如人类基因组的长序列时，需要鸟枪法将长序列变成短序列。并不是一个独特的测序方法，应该算是前处理技术。这些通过鸟枪法处理得到的短序列位点和长度随机，称为contigs（重叠群/连接片段）。然后用不同的测序方法测序，将结果输入电脑，它用算法（algorithm）将contigs的重叠部分进行拼接，得到完整序列。 Ion Torrent公司Proton测序仪 此方法比较快速。测序的原理与其他的不同，检测的不是荧光信号，而是核苷酸结合时释放的氢离子H+。同样全基因组→片段化，单链→连接adaptor→adaptors配对连接beads小分子→乳化PCR amplify。这些步骤与其他二代测序一样，不同的是Ion Torrent采用半导体芯片代替之前的孔板，加载携带序列的小分子在芯片上，芯片由可以承载小分子beads的孔和感受pH的传感器构成，这样前期准备就完成了。测序也是逐个加入四种核苷酸，检测产生的氢原子对溶液pH的影响，收集处理信号。 illumina 公司测序平台目前占据大部分市场，以HiSeq系列为主 (Quail et al., 2008) 特点是很便宜，速度也很快。①前期对基因组的片段化以及两端连接adaptorA,B与其他二代测序技术类似，②不同的是它没有用beads，核心反应容器是可以吸附流动DNA片段的测序流动槽（flowcell），每个flowcell上有8个道（lane），lane上面有与adaptorA,B相互配对的序列，所以可以固定DNA。③桥式PCR扩增与变性。先因为adaptorA,B序列而结合，形成拱桥性状，开始扩增，完成后双链和两端会再变性分开，新产生的单链作为模板再开始桥式反应。最后的结果是会产生一簇正反向的目的片段（详见下图）。④测序，检测荧光信号，整合结果。 第三代测序 PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies纳米孔单分子测序技术被称为第三代测序技术。其特点是不需要进行扩增，就是说小分子beads/桥式PCR的步骤是不需要的，而且产生的reads（读长）较长（>20kb）。PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015) 这个方法有点在上面提了，且速度快，由于是实时检测，所以还可以检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。但是缺点是错误率太高，以缺失序列和错位居多。SMRT芯片为测序载体（如同flowcell），不同碱基用不同荧光标记，在合成配对时检测荧光信号。 实现实时长序列测序的关键第一是采用的DNA聚合酶的活性保持，第二是区分配对的反应信号与周围游离碱基的强大背景荧光，采用零模波导孔原理，在反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多圆形纳米小孔达到降噪检测的目的。Oxford Nanopore  的MinION (Mikheyev and Tin,2014) 是基于电信号的测序。它的特点是仪器真的非常小，reads更加长（几十甚至上百kb），而且DNA在测序中不被破坏，但是错误率同样很高。它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理，这是因为存在表观修饰的碱基激发的电流强度是不同的。这对于在基因组水平直接研究表观遗传等相关现象有极大的帮助。 技术核心是特殊的纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。 参考文献 Albrecht, G., Brenner, S., Dubridge, ., Lloyd, ., and Pallas, . (2000) Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors. In: Google Patents. Hedges, ., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A. et al. (2011) Comparison of three targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform.  PloS one   6 . Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies.  Drug Discovery Today: Technologies   2 : 255-260. Maxam, ., and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA.  Proceedings of the National Academy of Sciences   74 : 560-564. Merriman, B., D Team, ., and Rothberg, . (2012) Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.  Electrophoresis   33 : 3397-3417. Mikheyev, ., and Tin, . (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer.  Molecular ecology resources   14 : 1097-1102. Quail, ., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, ., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.  Nature methods   5 : 1005. 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