单细胞测序毕业论文怎么写

目前植物的单细胞相关的文章大多集中在模式植物，例如拟南芥和水稻等。而研究组织叶大多集中在叶片和根。下面这个可能是我看到的第一篇关于烟草单细胞研究相关的文章，研究的是花冠细胞。 2022年1月，new phytologist在线发表了韩国sang-gyu kim团队题为“ Single-cell RNA-sequencing of Nicotianaattenuata corolla cells reveals the biosynthetic pathway of a floral scent ” 的研究论文。 该研究通过绘制烟草花冠细胞的单细胞转录图谱，鉴定了3765个花冠细胞，通过比较不同基因在3765个细胞之间的表达模式，鉴定了合成benzylacetone（BA）通路上的关键基因：NaPAL4, Na4CL, NaPKS2/3, NaAFR。同时验证的BA主要在花冠细胞的epidermal layer合成 ，为理解烟草BA的合成和调控规律提供了新的认知。 在这个研究中，作者选取单细胞测序的样品是：corolla limbs和throat cups（下图a）。然后选了三个时间点：ZT8，ZT12, ZT16。通过单细胞测序一共获得了3756个cell，其中从附表数据给出的几个参数来看：Median genes per cell (大约1000)，Reads map to genome（30%左右），个人觉得就单细胞测序数据quality是一般的。 通过UMAP结果，可以看出可以分成10个cluster（下图b），从三个不同时间点的聚类分布来看，也是差异不大的（下图c）。接下来就是对每个cluster进行注释了。文中作者指出，因为缺乏花中相关的marker gene，所以作者先de-novo获得每个cluster的marker gene，然后根据marker gene来注释每个cluster。其中主要用的marker gene是：cluster 7 (Pollen: pectin esterase genes, extension families和pollen allergens），cluster 8 (Phloem/xylem: SWEET11/12, SULTR2;1)，cluster 0/3/4/5/9 （Epidermal cell：ketoacyl-CoA synthase, ECERIFERUM4, wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase 1, lipid-transfer protein, glycerol-3-phosphate acyltransferase 6， cutin synthase-like）（下图d），cluster 6（chlorenchyma：photosystem I/II），cluster 1/2（parenchyma cell：因为cuticle合成相关的基因比较低，但是光合作用合成的基因比较高，下图e）。接下来，作者着重点研究了BA的合成。在花冠中，BA合成途径首先是由NaPAL4开始的（下图a）。然后接下来需要酶4CL/CNL。下面的一步有NaPKS完成（其中烟草中有4个member 1/2/3/4，但是不确认是那个member）。合成途径中除了已知的PAL4，PKS是不知道那个member，4CL和AER是不太清楚，没有验证。所以作者假设，基于已知的PAL4，合成途径上的其它基因应该在单细胞level和PAL4有很强的相关性，或者表达patter一致（这和研究基因和基因的调控一样）。 所以作者计算了单细胞测序鉴定出来的所有基因和PAL4的相关性（下图b），同时用发表的RNA-seq数据做了同步的双向验证。从结果来看，单细胞结果和RNA-seq的结果有一致的，比如高相关性的4CL1基因，以及PKS2/3，AER1。但是也有不太一致的，比如从相关性分布来看，单细胞的更集中，更符合正态分布（下图c）。还有IFR3就相差很大。然后，作者开始分别验证获得的4CL1，PKS2/3，AER1基因在BA合成过程中的作用。 下图是4CL1敲除的结果。从VIGS敲除来看，敲除4CL1后，花冠顶部和内部4CL1的表达量明显降低（下图a/b），BA含量也都明显降低（下图a/b）。并且代谢产物的类型是cinnamic acid和coumaric acid，而不是caffeic acid和ferulic acid。另外作者也查看了在这个4CL1的敲除材料中，其它4CLmember并没有受影响。然后，作者尝试去验证PKS2/3的功能。从PKS2/3的敲除材料中可以看出，不管是顶部还是内部BA的含量都显著降低（下图a/b）。但是由于PKS家族的高度相似性，PKS1/4在敲除材料中也有所下降。当时当作者把PKS2和PKS3分别加入4CL1的产物CINNAMOLY-CoA中后发现，只有在加入PKS2的反应物中鉴定到了BA，而PKS3中则没有鉴定到（下图c）。从而说明在这个过程中主要是PKS2这个基因起着关键的作用，并且PKS2的相关性也是远强于PKS3的。同样的测试了AER1在BA合成过程中的功能。同样滴，在AER1的敲除材料中，在花冠顶部和内部，BA的含量都显著降低（下图a/b）。进而，在AER1的敲除植株中鉴定到了一个新的benzalacetone化合物（下图c），是BA的一种非还原形式。并且这个新的化合物在野生型的花冠顶部是不存在的（下图c）。证明完这个4个基因在BA合成过程中的作用后（ 其实个人觉得这4个基因的发现过程好像也不需要单细胞数据，貌似普通的多组织RNA-seq也能实现，毕竟这4个基因RNA-seq的结果也是包含的 ），作者开始利用单细胞数据来探索这4个基因在不同细胞中的分布规律。然后发现在3756个细胞中，1097个细胞包含这4个基因，而这1097个cell基本都集中在cluster 0/3/4（下图a）。而从4个基因在不同细胞的表达pattern也是可以明显发现主要在cluster 0/3/4富集（下图b/c）。这3个cluster已经知道是epidermal cell了，所以可以合理的假设和猜测BA可能是在花冠的epidermal cell中合成的。GFP定位信息也说明这几个基因主要在epidermal cell中表达（下图）。因为BA在花冠中的合成是受生物钟的调节的所以作者接下来查看了这4个关键的功能基因对于生物钟节律的调控关系。从表达pattern来看，这4个功能基因的表达是随着时间有着节律的变化（下图a），和已知的节律基因类似（下图a），同样的还有BA的含量变化（下图a）。因为单细胞取样是取了3个时间点的，包含白天和晚上的点。所以作者也查看了在单细胞数据中这4个基因的变化，也可以明显看出明显在白天12h有个peak（下图b）。然后作者测定了BA以及4个关键的合成基因在corolla limb和corolla tube中的差异，从化合含量可以看出BA主要在limb中，从表达来说，尽管PAL和4CL在tube中也有表达，但是PKS2和AERA在tube中几乎不表达，再次证明了BA的合成部位（下图c）。