基因克隆毕业论文内容提要

摘要 世纪70年代诞生的基因工程、克隆技术和干细胞研究等现代生物技术, 使生命科学的发展进入了一个新阶段, 这些以创造或改变生物类型及生物机能为目标的现代生物技术已成为新技术革命的三大支柱之一。通过探寻生命本质及生长发育、疾病、衰老等奥秘, 揭示生命现象的内在规律。随着生物技术在医药、食品化工、农业、环保以及能源、采矿等工业部门中的广泛应用, 它正在对人类经济及社会生活和社会进步产生深刻而广泛的影响。关键字：生命科学 生物技术 人类生活 影响随着生物科学的发展，生物科学技术对人类社会的影响越来越大。这主要表现在以下几个方面： 1.影响人们的思想观念，如进化的思想和生态学思想正在被越来越多的人所接受。 2.促进社会生产力的提高，如生物技术产业正在形成一个新兴产业；农业生产力因生物科学技术的应用而显著提高。 3.随着生物科学的发展，将会有越来越多的人从事与生物学有关的职业。 4.促进人们提高健康水平和生活质量，延长寿命。 5.影响人们的思维方式，如生态学的发展促进人们的整体性思维；随着脑科学的发展，生物科学技术将有助于改进人类的思维。 6.对人类社会的伦理道德体系产生冲击，如试管婴儿、器官移植、人基因的人工改造等，都会对人类社会现有的伦理道德体系产生挑战。 7.生物科学技术的发展对社会和自然界也可能产生负面影响，如转基因生物的大量生产改造物种的天然基因库，可能会影响生物圈的稳定性。 理解科学技术与社会的关系，是科学素质的重要组成部分。一、生物与基因科技 生物与基因科技的进展，已促使生物医学的研究迈入后基因体医学时代，这些尖端医疗科技在提升人们健康福祉的同时，也给家庭和社群等各个层面前带来所未有的影响。其中有些影响或许还是潜在的。 （1）基因改造作物(genetic modified organism) 科学家以基因改造的方式改良农作物，以促进收成、防治病虫害、提高经济效益，希望可以解决人类粮食不足或营养问题，但是基因改造作物会不会创造出新的过敏原、对人体造成新的健康问题、引起昆虫的抗药性、制造所谓的基因污染？基因改造作物所带来对自然与人类社会的风险、安全性与效益如何评估？基因改造作物的专利权将如何规范？其巨大商业利益是否将加剧资本家对弱势族群、第三世界国家的经济控制或剥削？究竟，人与植物、自然生态的理想关系应该如何?（2）基因检测(Genetic testing)： 基因检测有助于遗传疾病的诊断、预防及处置，执行的时机常见于婚前健康检查、胚胎植入前检测、产前检查、新生儿筛检、儿童及成人的遗传检验等，检测的性质又可分诊断检测、带原者检测、发病前检测、罹病倾向检测。由于遗传信息不仅关乎个人，同时也与家庭或家族其他成员的健康息息相关，因此遗传信息的获得与告知时常带来特殊的医学伦理问题，包括：基因信息带来的心理负担及社会压力，基因诊断结果的告知对个人与家庭、家族的影响，个人隐私的保障与家庭成员利益产生冲突，基因检测引起的医疗资源分配、社会正义议题等。 （3）基因治疗(gene therapy)： 科学家透过基因治疗希望能为人类目前各种主要的死亡原因、慢性疾病、遗传疾病的治疗带来曙光，一般分为体细胞基因治疗及生殖细胞基因治疗。体细胞基因治疗乃针对已发病或将发病患者的体细胞，在基因的层次作医疗介入，以病毒为载体、或使用物理方式将好的基因传送到欲治疗的体细胞或组织，以取代或修补有缺陷的基因，并发挥正常生理功能。体细胞基因治疗的相关伦理议题与一般新进医学科技、临床试验所必须考量的内涵大致相同。其中，应采取何种程序方能公平选出接受治疗的病患？应采用何种步骤以确保患者或其父母或监护人的知情同意？生殖细胞基因治疗则是对生殖细胞或胚胎进行基因调控，以期根绝病因、一劳永逸，然而对生殖细胞直接进行基因介入却可能改变新生儿的遗传组合、造成长远的医源性的伤害，同时可能引起设计家宝宝、基因超市、出卖基因以牟利、政变人种等发展的疑虑。这些问题正在或即将对人类的家庭、社会伦理观念与道德实践带来重大的冲击，理应纳入到生命伦理学的思考范围之内。

基因克隆技术给人类生活带来美好的前景，故寄予了无限的期望。下面是我整理了基因克隆技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

差异表达基因克隆技术的新进展

提要 分离并克隆差异表达基因是 目前 功能性基因 研究 的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及 应用 ，这些技术将会不断完善与 发展 ，具有广阔的应用前景。

关键词 差异表达基因;克隆

现代 分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与 治疗 提供重要的 理论 依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。

一、mRNA差异展示

mRNA差异展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5´端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3´端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3´端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端锚定引物与5´端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5´端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3´端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。

总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列 问题 ，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。

二、代表性差示 分析

代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增目的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72℃ 复性与延伸及95℃变性这两个循环参数，共20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表达，则难达到预期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期长。

三、抑制性扣除杂交

抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一种新的克隆基因技术，其基本原理是：先将T与D方cDNA用限制酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复发，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适引物接头(接头1与接头2引物)进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受到抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。

此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基因，与DDRT-PCR相比，具有假阳性少重复性强的优点，它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较。

四、差异消减展示

差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与对照方的相应范围的条带，靶方回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，而对照方回收的差异条带用含生物素标记的dATP的dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTPs进行扩增，再重复差异展示，回收差异条带并克隆。此技术最大的优势是获得差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少，敏感性强，可获得长片段，起始材料要求少，可获取低丰度差异表达基因，缺点是步骤繁琐，工作量大，周期性长，更多依赖于PCR技术。

另外，赵忠良博士把长片段PCR扩增(LPCR)与消并减杂交技术结合起来，建立了LPS技术，并运用此技术从抗原呈细胞中获取了170多个差异表达基因。此技术的基因原理是：T与D方分离出cDNA后，运用5´端帽子引物与3´端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，其产物直接进行消减杂交，然后过柱子，去除相同的基因，剩余的部分再与D方cDNA进行二轮消减杂交，再过柱子，去除非差异部分，剩下的差异部分进行第三轮消减杂交，其产物进行分级分段克隆。这种 方法 最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。

总之，随着高效扩增的Taq酶与具有自动校正功能的Taq酶的出现，长片段PCR扩增技术的优化，差异表达基因克隆技术将会不断 发展 ，但 目前 主要有以上几种方法，各有其优缺点， 研究 者应根据自己的实际情况，选择合适的技术方法，以其达到自己预期的目的。

参考 文献

1 Liang P et (14):967

2 Ito T et letters,1994;351:231

3 Ayala M et ;18(5):842

4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat ) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12

5 Cui DX et of the Fourth Military university,1998;18(6):601

6 Hubank M et Acids Res,1994;22:5640

7 Diatchenko L et Natl Sci USA,1996;93:6025

8 Jose RP et Biochemistry,1998;257:161

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